UNIVERSIDAD VERACRUZANA FACULTAD DE BIOLOGÍA

“Aislamiento de Leucocoprinus gongylophora a partir de un jardín de hongo de Atta mexicana.”

TESIS TRABAJO DE EXPERIENCIA RECEPCIONAL QUE PRESENTA:

INÉS MARGARITA ZAVALA IZQUIERDO

DIRECTOR:

ÁNGEL RAFAEL TRIGOS LANDA.

CO-DIRECTOR:

CÉSAR ESPINOZA RAMÍREZ

Xalapa, Veracruz.

Febrero 2014.

AGRADECIMIENTOS. Agradezco a mi Director Dr. Ángel Trigos Landa y a mi co-director Dr. César Espinoza por todo su conocimiento brindado para la conclusión de este trabajo. Por su apoyo, tiempo y confianza que depositaron en mí y tenerme la paciencia requerida. Quiero agradecer también al Dr. Jorge Valenzuela y al Instituto Universitario de Biorgánica “Antonio González” de la Universidad de la Laguna Tenerife España porque sin su aporte, este trabajo no habría podido llevarse a cabo. De igual forma agradezco al Proyecto de Ciencias Básicas del CONACYT, con clave 181820 “Búsqueda de sustancias citotóxicas a partir de Hongos Microscópicos”. A mi comité tutorial comprendido por la Dr. Rocío Coutiño, Dr. Socorro Fernández y el Dr. Armando Lozada y a mi maestra de Experiencia Recepcional María de los Ángeles Chamorro, por todo su apoyo. Agradezco de manera muy especial a mis padres José Javier y Romelia por su apoyo incondicional, quienes a pesar de mis tropiezos siempre me han brindado su mano y depositado su fe en mí. A mi hermana Irma Jazmín, por sus ánimos para seguir adelante y no rendirme en el camino. A mi hermana Irene Violeta por sus buenos consejos. A todas aquellas personas que compartieron el área de trabajo, por brindarme sus conocimientos y hacer ameno aquellos días difíciles.

Dedico este trabajo, a mis padres y hermanas, gracias por todo su apoyo. A mis abuelitos que sé, estarían orgullosos de mí.

Contenido

CONTENIDO. ÍNDICE. 1.

RESUMEN. ....................................................................................... 1

2.

INTRODUCCIÓN. ............................................................................... 2

3. MARCO TEÓRICO ................................................................................. 4 3.1 El reino Fungi. ................................................................................... 4 3.1.1 Características generales. ................................................................................................... 4 3.1.2 Clasificación de los hongos. ............................................................................................... 6 1.1.3

Relaciones simbióticas de los hongos. ........................................................................ 8

3.3 Micófagas u hormigas cortadoras de hojas. .................................................... 11 3.3.1 Descripción del género Atta. ............................................................................................ 13 3.3.2 Formación del hormiguero y el jardín de hongo. ............................................................. 14 3.3.3 Organización social. ......................................................................................................... 17 3.3.4 Clasificación y recolección del material vegetal. ............................................................. 18 3.3.5 El hongo y su relación simbiótica. ................................................................................... 19 3.3.6 Hongos y bacterias asociados a la simbiosis. ................................................................... 22 4. OBJETIVOS. ....................................................................................... 24 5.1 OBJETIVO GENERAL. ....................................................................... 24 5.2 OBJETIVOS PARTICULARES. .............................................................. 24 5. HIPÓTESIS. ........................................................................................ 25 6. METODOLOGÍA. ................................................................................. 26 6.1 Obtención del material biológico (INECOL). ................................................. 26 6.2 Mantenimiento del jardín de hongo. ........................................................... 28 6.3 Selección del medio de cultivo. ................................................................ 28 6.3.1 Desinfección del material biológico. ................................................................................ 28 6.3.2 Medios de cultivo. ............................................................................................................ 29 6.4 Aislamiento de Hongos. ........................................................................ 30 6.5 Identificación de los hongos aislados. ......................................................... 31 7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. .................................................................. 33 7.1 Selección del medio de cultivo. ................................................................ 33 7.2 Aislamiento de las cepas fúngicas. ............................................................. 34

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7.3 Identificación de las cepas fúngicas. ........................................................... 39 7.3.1 Fusarium sp. Link 1809). ................................................................................................. 40 7.3.2 Penicillium sp. Link (1809). ............................................................................................. 42 7.3.3 Geotrichum sp. Link (1809). ............................................................................................ 43 7.3.4 Leucocoprinus gongylophora (Möller) Dörfelt & Creutzb .............................................. 45 8. CONCLUSIONES. ................................................................................. 48 9. PERSPECTIVAS Y APLICACIONES ............................................................ 49 9.1 Inhibición de Quorum-sensing. ................................................................ 49 10. REFERENCIA. ................................................................................... 50

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ÍNDICE DE FIGURAS. Figura 1. Estructura de un talo o micelio de mohos y levaduras, y en la parte inferior dos formas poco frecuentes. (Modificada de Deacon. Introducción a la micología médica. Noriega-Limusa, 1998; citado de: Arenas, 2008). ................................................................. 5 Figura 2. Estructura de las hifas (Campbell et al., 2005). ..................................................... 5 Figura 3. Distribución de las hormigas pertenecientes a la tribu Attini. (Vergara-Castrillon, 2005). .................................................................................................................................... 11 Figura 4. Esquema de un corte transversal de un nido de Atta, con las galerías que terminan en las cámaras de cultivo del hongo. Las galerías más anchas sirven de ducto de ventilación. (Jaffe, 1993). ..................................................................................................... 15 Figura 5. Conjunto de gongylidias, igual conocido como staphylae observada bajo un microscopio óptico. Cada una de las esferas corresponde a una gongylidia (1000X) (Schneuder y Odair, 2003, citado de: dos Santos et al., 2013). ............................................ 20 Figura 6. A) Vista de la forma del crecimiento de la bacteria filamentosa Actinomycetous, que muestra el patrón de crecimiento típico y su espesor en la cutícula. Escala 10 µm. B) Vista de Streptomyces (flecha), en el marco de las patas delanteras de Apterostigma sp. este es el lugar característico de la bacteria en los géneros de Attini. Escala 100 µm. C) Vista ventral de una obrera de Acromyrmex. El Actinomiceto se puede ver justo debajo de cabeza, en el propleuron de la hormiga. Escala 500 m (Currie et al., 1999). ....................... 23 Figura 7. Hormigas reinas antes de deglutir el hongo. ........................................................ 27 Figura 8. Colonia en el terrario artificial. INECOL. ........................................................... 27 Figura 9. Aislamiento fúngico 1 del género Fusarium sp., aislado del nido 1. Fotografía tomada a los 15 días de cultivo............................................................................................. 35 Figura 10. Aislamiento fúngico 2, género Fusarium sp., aislado del nido 1. Fotografía tomada a los 15 días de cultivo............................................................................................. 35 Figura 11. Aislamiento fúngico 3, género Fusarium sp., aislado del nido 1. Fotografía tomada a los 15 días de cultivo............................................................................................. 36 Figura 12. Aislamiento fúngico 4, género Geotrichum sp., aislado del nido 1 y 3. Fotografía tomada los 15 días de cultivo. ............................................................................. 37

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Figura 13. Aislamiento fúngico 5, Leucocoprinus gongylophora, aislado del nido 1, 2 y 3. Fotografía Tomada a los 30 días de cultivo. ......................................................................... 38 Figura 14. Aislamiento fúngico 6, Penicillium sp., aislado del nido 3. Fotografía tomada a los 7 días de cultivo. ............................................................................................................. 38 Figura 15. Aislamiento fúngico 7, Penicillium sp., aislado del nido 3. Fotografía tomada a los 7 días de cultivo. ............................................................................................................. 39 Figura 16. Macroconidias. Imagen a) de la cepa fúngica 1; Imagen b) de la cepa fúngica 2; imagen c) de la cepa fúngica 3. Pertenecientes Fusarium sp. Vista al microscopio óptimo 100X. .................................................................................................................................... 41 Figura 17. Fialides monoverticeladas. Aislamiento fúngico 7, Penicillium sp., del jardín 3. Microscopio óptico, vista 100X............................................................................................ 42 Figura 18. Fialides terverticilados. Aislamiento fúngico 6, Penicillium sp., del jardín 3. Microscopio óptico, vista 100X............................................................................................ 43 Figura 19. Hifas tabicadas, hialinas. Aislamiento fúngico 4, Geotrichum sp., del jardín 1 y 3. Vista 100X. ...................................................................................................................... 44 Figura 20. A) Staphilae= conjunto de gongylias, tomado de forma directa del jardín de hongo in vivo. B) Staphilae= conjunto de gongylias, tomado del aislamiento in vitro. Aislamiento fúngico 5, Leucocoprinus gongylophora, del jardín 1, 2 y 3. Vista a 100X. .. 45 Figura 21. Gongylidia. Vista 100X. ..................................................................................... 46

ÍNDICE DE TABLAS. Tabla 1. Clasificación de los hongos. (Carrillo, 2003). ......................................................... 6 Tabla 2. Diferencias morfológicas entre especímenes y nidos de los géneros de hormigas (Herrera-Salazar, 2009). ....................................................................................................... 12 Tabla 3. Crecimiento de hongos en diferentes medios de cultivo. ..................................... 33 Tabla 4. Hongos encontrados en los tres jardines de hongo de Atta mexicana, proporcionados en el INECOL. ............................................................................................ 34

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1. RESUMEN. Las hormigas pertenecientes a la tribu Attini, cumplen una simbiosis mutualista obligatoria con algunos hongos de los cuales se alimentan. La especie Atta mexicana en específico, se encarga de cultivar un hongo agrupado en la división de los Basidiomycetes, clasificado actualmente como Leucocoprinus gongylophora. Este hongo debido a la relación tan estrecha que mantiene con las hormigas, ha perdido la capacidad de producir esporangios, estructuras necesarias para su identificación, lo que causa que está sea más complicada. En este trabajo se realizó el aislamiento en medio MEA, de los hongos encontrados en el jardín de hongo de A. mexicana, para su posterior identificación, analizar su composición química y propiedades biológica. A pesar de las dificultades, se obtuvo el aislamiento de L. gongylophora, el cual se identificó por presencia de las gongylidias, estructuras que lo caracterizan. También, se halló hongos asociados al jardín, que basándonos en lo reportado, se sabe no perjudican al hongo del que se alimentan las hormigas.

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2. INTRODUCCIÓN. Las hormigas defoliadoras (Hymenoptera: Formicidae, Tribu Attini) comprenden 200 especies, endémicas de América, de las cuales 17 se encuentran en México (Garling y Rettenmeyer 1978, citado de: Fortanelli-Martínez et al., 2001). Las especies más frecuentes son Atta fervens, A. mexicana, A. cephalotes y A. texana (Blackaller, 1955; Mintzer, 1979; citado de: Fortanelli-Martínez et al., 2001).

La especie Atta mexicana (F. Smith), al igual que todas las especies de la tribu Attini, son cultivadoras de hongos y dependen en gran medida para su alimentación del cultivo de hongos que mantienen en el interior de sus hormigueros (Wheeler, 1910; Weber, 1966; Quinlan y Cherret 1979; citado de: Rojas, 1989).

El hongo que cultivan estas hormigas es Leucocoprinus gongylophora (Möller) Dörfelt & Creutzb, del reino Fungi, Phylum Basidiomycota, clase Agaricomycetes, orden Agaricales y familia Agaricaceae (Index Fungorum, 2008). Este hongo suministra a las hormigas nutrientes obtenidos a partir de materiales vegetales que metabolizan, originando hifas ensanchadas apicalmente denominadas gongylidios, que nutren a la reina e hijas de una colonia (Aylward et al., 2012; Martin y Martin, 1970; citado de: Lugo, 2013). A cambio, su entorno está muy protegido por las hormigas que eliminan los contaminantes con antibióticos que secretan de sus glándulas metapleurales (dos Santos et al., 2013). Existiendo así, una simbiosis obligada entre este hongo basidiomiceto y las hormigas cortadoras de hojas de la tribu Attini (Silva-Pinhati et al., 2005). Relación que se ha desarrollado hasta llegar el grado de que el hongo pierda la capacidad de producir esporangios (Weber, 1972; citado de: Mohali, 1998).

La comprensión de este mutualismo se ha visto obstaculizado en gran medida por la falta de información sobre la ubicación taxonómica y la historia evolutiva de los cultivos fúngicos (Currie, 2001). La dificultad principal ha sido la renuencia del hongo para producir esporóforos, los cuales son las estructuras fructíferas requeridas para la identificación taxonómica (Loeck et al., 2004). No existen reportes sobre el aislamiento in

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vitro del hongo cultivado por la hormiga A. mexicana, y debido al poco estudio reportado, es por ello, que en este trabajo se pretende aislar y purificar cepas del hongo L. gongylophora y aquellos hongos cosmopolitas asociados al jardín de hongo de la hormiga A. mexicana, para que en trabajos posteriores se puedan realizar análisis sobre su composición químico orgánica y sus propiedades biológicas.

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3. MARCO TEÓRICO 3.1 El reino Fungi. 3.1.1 Características generales. Los hongos constituyen un grupo de organismos de gran interés, se encuentran ampliamente distribuidos por todo el globo terrestre y viven en cualquier sitio que presente material orgánico, agua y temperatura apropiada (Bold et al., 1989; citado de: MatamorosLeón, 1995).

La mayoría de los hongos tienen como principal hábitat natural el suelo, donde juegan un papel importante en la degradación de la materia orgánica (Bonifaz et al., 2007).

Son organismos eucarióticos, aerobios, no fotosintéticos, inmóviles; tiene una pared celular que constituye el 90 % del peso seco del hongo, la cual está constituida de polisacáridos como: quitina, celulosa, glucanas y mananas, entre otros; esto constituye entre el 70 y al 80 % y el 10 al 20 % lo forman las proteínas y glicoproteínas. Esta pared le imparte al hongo rigidez, actúa como barrera osmótica y determina la forma del microorganismo (Macola-Olano, 2007). Todos son heterótrofos por lo que tienen que alimentarse de materia orgánica preformada que utilizan como fuente de energía y de carbono. Absorben sus nutrimentos, simples y solubles, que obtienen al desintegrar polímeros mediante enzimas extracelulares llamadas despolimerasas (Arenas, 2008). Sintetizan lisina, por biosíntesis del ácido L-aminolipídico: tienen microtúbulos compuestos de la proteína tubulina, ergosterol en sus membranas celulares, centriolo, mitocondrias, ribosomas, núcleo rodeado de membrana, retículo endoplásmico y mitocondrias (Macola-Olano,2007).

La estructura fúngica consta de un complejo llamado talo o micelio que, a su vez, está constituido por múltiples filamentos o hifas (hifomicetos o mohos) o, menos a menudos, por estructuras unicelulares o levaduras (blastomicetos); las hifas se reproducen por gemación y casi nunca por fisión binaria (Figura 1) (Arenas, 2008). Las esporas son

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cuerpos resistentes que forman los hongos en estado latente o de reposo, que se reproducen de dos maneras diferentes sexual y asexualmente (Moreno, 2000; citado de: AriasCifuentes et al., 2008).

Figura 1. Estructura de un talo o micelio de mohos y levaduras, y en la parte inferior dos formas poco frecuentes. (Modificada de Deacon. Introducción a la micología médica. Noriega-Limusa, 1998; citado de: Arenas, 2008).

Las hifas a menudo están divididas por tabiques llamadas septos. En cada hifa hay uno o dos núcleos y el protoplasma se mueve a través de un diminuto poro que ostenta el centro de cada septo. También existen hifas llamadas cenocíticas porque no se dividen en células individuales, sino que tienen el aspecto de una célula gigante multinucleada alargada (Figura 2) (Guzman et al., 1993; citado de: Carranza-Díaz, 2006).

Figura 2. Estructura de las hifas (Campbell et al., 2005).

Otra característica importante de los hongos es la producción de metabolitos secundarios de interés en medicina y en biotecnología, un aporte de esto es el realizado por

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Trigos y colaboradores en el 2011, donde mostraban un panorama general de los principales metabolitos biológicamente activos del género Ganoderma sp. los cuales se han utilizado para el tratamiento y la prevención de diversas enfermedades como cáncer, hipertensión y diabetes, entre muchas otras. Como aspecto negativo debemos destacar la capacidad, que presentan un número importante de hongos, de producir enfermedades en el hombre y en los animales que pueden traducirse en alergias o infecciones fúngicas (Guarro, 2011).

3.1.2 Clasificación de los hongos. Los hongos se clasifican dependiendo de las características de su heterotrofismo, formación de esporas, presencia de quitina en sus paredes y cuerpos fructíferos (Tabla 1). (Alexopoulus, 1995). En la actualidad se distinguen fundamentalmente cuatro grupos mayores dentro de los hongos: los Quitridiomicetos, los Zigomicetos, los Ascomicetos y los Basidiomicetos. La separación del grupo de los quitridiomicetos se basa en la formación de esporas asexuales móviles mediante un flagelo posterior. Los otros tres grupos de hongos se distinguen por el mecanismo de reproducción sexual (Ruíz-Herrera, 2008).

Tabla 1. Clasificación de los hongos. (Carrillo, 2003).

FUNGI: osmotróficos, pared con quitina Chytridiomycota: unicelular o micelial, holo o eucárpico, zoosporas con un flagelo posterioro raramente varios No se encuentran elementos de tabla de ilustraciones. Zygomycota: micelio en general cenocítico, zigosporas por conjugación hifal oTrichomycetes: parásitos de artrópodos, adheridos a la superficie oZygomycetes: saprobios en su mayoría, si parásitos están inmersos en el tejido hospedante, mitosporas por lo común en esporangios Ascomycota: meiosporas dentro de ascas, anamorfosconidiales oAscomycetes: micelio septado, ascas en ascomas diversos oTaphrinomycetes: parásito, micelio subcuticular o subepidérmico, ascas desnudas oSaccharomycetes: levaduras brotantes, ascas libres oSchizosaccharomycetes: levaduras que se multiplican por fisión, ascas libres Basidiomycota: meiosporas sobre basidios o estructura equivalente, micelio con

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septos doliporo o levaduras oBasidiomycetes Agaricomycetidae: basidioma visible carnoso, coriáceo o duro; hifas con fíbulas; basidio sin septos primarios sobre laminillas, poros o en gasteroma; saprobios (epígeos, hipógeos o lignícolas) o ectomicorrízicos, raramente parásitos Tremellomycetidae: basidioma visible gelatinoso o ceroso; basidio septado; lignícolas omicoparásitos oUrediniomycetes: meiosporas en soros, micelio sin fíbulas, parásitos obligados de plantas o insectos.Ustilaginomycetes: con fase levaduriforme, septo hifal por lo común sin doliporo Hongos Anamórficos: no correlacionados con meiosis oHyphomycetes: micelio con conidios, conidióforos separados o reunidos en coremios o esporodoquios oCoelomycetes: micelio con conidiomas oAgonomycetes: micelio que solo presenta clamidosporas, bulbillos o esclerocios.

Otra forma de agrupar a los hongos es según sus características microscópicas o macroscópicas, que pueden ser filamentosos, levaduriformes y dimorfos (Macola-Olano, 2004).

3.1.2.1 Hongos filamentosos. Son microorganismos eucarióticos, aerobios facultativos que se reproducen de manera natural por esporas, sexual o asexualmente (Vargas y Villamizar, 2005; citado de: AriasCifuentes, 2008). Fisiológicamente, los hongos filamentosos se adaptan a condiciones más severas que otros organismos, su desarrollo en sustratos puede ser con concentraciones de azúcares elevados, hasta el 10 %, debido a que estos microorganismos no son sensibles a la presión osmótica elevada; creciendo muy lentamente de 5 a 7 días, y resistiendo condiciones de acidez relativamente altas (pH entre 2-9, óptimo pH: 5-6) (Moreno, 2000; citado de: Arias-Cifuentes et al., 2008). Como ejemplo podemos mencionar: Aspergillus fumigatus, Scedosporium spp., Fusarium spp., y Mucorales (Mellado et al., 2002).

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3.1.2.2 Hongos levaduriformes. Las levaduras presentan formas diversas, esférica, ovoide, elipsoidal y cilíndrica; crecen de forma isodiamétrica (por todos lados) constituyendo la parte vegetativa y en poco tiempo se reproducen asexualmente por gemación, fisión binaria o fragmentación. Algunas levaduras forman cadenas, estructuras a las que se denomina pseudohifas (por lo que la agregación de varias de ellas se conoce como pseudomicelio). Las colonias generalmente son poco elevadas y de consistencia suave, cremosa, y su color oscila, en general, entre blanco-amarillo, aunque algunas contienen pigmentos carotenoides (Castañón et al., 2013). Son unicelulares y tienen aspecto viscoso cuando crecen en medio sólido (Wainwright, 1995). Entre los hongos levaduriformes citamos a: Candida sp., Levadura oportunista, componente de la flora normal humana; Malassezia furfur, levadura lipofílica que forma parte de la flora normal de la piel y el cuero cabelludo, es agente causal de la pitiriasis versicolor y de la dermatitis seborreica (Sanabria et al., 2002).

3.1.2.3 Hongos Dimórficos. Son aquellos que crecen tanto en la forma filamentosa como en la levaduriforme, según sus factores: la temperatura y los nutrientes. El cambio puede ser: solo debido a los nutrientes, solo por la temperatura o por ambos factores; en este grupo se halla a la mayoría de los hongos patógenos (Macola-Olano, 2004). Un ejemplo de ellos es el Geotrichum candidum, el cual es un hongo tipo levadura filamentosa que se puede aislar de diversos hábitats, como lo es el suelo, el agua, la leche, plantas, frutos, insectos, el hombre y otros mamíferos (Hudecova et al., 2009).

1.1.3 Relaciones simbióticas de los hongos. Los hongos no son sólo importantes para la sociedad humana también establecen relaciones bastantes estrechas con otros organismos (Moreira-Arana et al., 2007). Debido a que los hongos carecen de clorofila, su nutrición es heterotrófica y de acuerdo con la clase de sustancias orgánicas que aprovechen, pueden ser saprófitos, simbiontes o parásitos (Bold et al., 1989; citado de: Matamoros-León, 1995).

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Los saprobios utilizan sustancias orgánicas inertes, muchas de ellas en descomposición, que pueden ser reservas de otros organismos, productos de excreción y excremento de los mismos, o restos de vegetales y animales. Los parásitos se desarrollan en otros organismos vivos que constituyen sus hospedantes y se nutren de las sustancias que hay en sus células vivas. Los simbiontes se asocian con otros seres vivos, prestándose mutua ayuda en sus funciones (Herrera et al., 1998).

Un individuo simbionte es aquel que vive en o sobre el huésped y que por lo general es el participante de menor tamaño, en una simbiosis (Campbell et al., 2005). Podemos definir a la palabra simbiosis como una asociación entre dos o más especies diferentes de organismos; la asociación puede ser permanente, es decir, que los organismos nunca se separan o puede ser de larga duración (Parecer et al., 1999). Se ha reportado que los hongos forman relaciones simbióticas con plantas, algas, cianobacterias y animales (Campbell et al., 2005). De estas relaciones las más conocidas son aquellos que se asocian con algas (líquenes) y plantas vasculares (micorrizas). Con respecto a las simbiosis o relaciones mutualistas de hongos con animales, se puede indicar que algunos hongos viven asociados con ciertos insectos coleópteros, homópteros, himenópteros e isópteros. Los insectos son los únicos animales que han desarrollado relaciones mutualistas con los hongos, y esto puede deberse a que muchos insectos y hongos comparten los mismos hábitat (Herrera et al., 1998). Un ejemplo de relación mutualista es aquella existente entre un hongo Basidiomycete y las hormigas del género Atta. El interés del hongo es servir para su existencia de la protección contra fungívoros y parásitos. Y para la hormiga del género Atta las ventajas de este mutualismo son enormes, su dieta principal es el hongo, el cual es el consumo exclusivo de las larvas (Keller y Gordon, 2009).

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3.2 Hymenopteros. Las hormigas son un grupo de insectos diverso y abundante en ecosistemas terrestres, se encuentran presentes desde el nivel del mar hasta los 4, 000 metros de altitud. Se agrupan en la familia Formicidae, que se divide en 21 subfamilias y se han descrito más de 12,600 especies en todo el mundo, siendo los trópicos los puntos con la mayor diversidad (Bolton et al., 2006; Fernández y Ospina, 2003; Hölldobler & Wilson, 1990; Lattke, 2003, citado de: Vásquez-Bolaños, 2011).

La diversidad funcional de las hormigas abarca un amplio espectro de gremios tróficos, y la asignación de una especie a una determinada categoría trófica no siempre es fácil, ya que las preferencias alimenticias pueden cambiar espacial y temporalmente en función de factores intrínsecos (necesidades energéticas de la colonia) o extrínsecos (disponibilidad de un recurso en el ambiente) o ambos (Rojas-Fernández, 2001). Lo que permite clasificarlas en omnívoras, micófagas, granívoras y depredadoras. (Longino y Hanson 1995, citado de: Herrera-Salazar, 2009).

Este trabajo se enfocó solo a un género en particular, perteneciente a la clasificación de las micófagas. Las especies de este gremio trófico son exclusivas de la tribu Attini (Myrmicinae), cultivan hongos dentro de sus nidos y su dieta está formada casi enteramente por el micelio (Weber 1972, citado de: Herrera-Salazar, 2009).

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3.3 Micófagas u hormigas cortadoras de hojas. La hormiga arriera se estima que tiene su origen desde hace unos 65 millones de años y desde entonces ha tenido una constante evolución en nuestro medio. Se encuentra desde el sur de los Estados Unidos hasta el norte de Argentina, ubicándose únicamente en el continente Americano (Figura 3) (Vergara-Castrillon, 2005). Pertenecen a la tribu monofilética Attini (Hymenoptera - Formicidae - Myrmicinae), que se compone de 12 géneros y aproximadamente 210 especies.

Figura 3. Distribución de las hormigas pertenecientes a la tribu Attini. (Vergara-Castrillon, 2005).

Las hormigas Attini se han dividido en dos grupos (Mueller, 2002; citado de: Sánchez-Peña, 2005): los “Attini menores”, que incluyen Myrmicocrypta, Apterostigma, Mycocepurus, Mycetarotes, Mycetosoritis, Cyphomyrmex y Mycetophylax y los "Attinis superiores", que se subdivide en dos grupos, el clado Trachymyrmex y Sericomyrmex y el clado que incluye Acromyrmex y Atta (Sánchez-Peña, 2005). Entre todos los Attini, normalmente se conocen como cultivadores de hongos, estos dos géneros derivados filogenéticamente, Acromyrmex y Atta

(Miyashira et al., 2010).

Comúnmente conocidos como “cortadoras de hojas”, “arrieras”, “chicatanas” ó “chicantanas” (Landero-Torres et al., 2009). Son originarias del Neotrópico y se encuentran en su mayoría en los bosques húmedos tropicales de Sudamérica. Ambos géneros se encuentran distribuidos entre los 33° de Latitud Norte y los 33° de Latitud Sur del continente americano (desde el sur de los Estados Unidos hasta Argentina). Se presentan desde el nivel del mar hasta los 2,000 a 3,000 metros de altura. (Escobar-Durán, 2002).

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Se ha reportado que en el género Acromyrmex se reconocen 23 especies y en el género Atta el número de especies reconocidas es de 14. (Escobar-Durán, 2002). Estos géneros se diferencian entre sí debido a su color y tamaño, así como el nido en donde habitan (Cuadro 1).

Tabla 2. Diferencias morfológicas entre especímenes y nidos de los géneros de hormigas (Herrera-Salazar, 2009).

Género Acromyrmex Género Acromyrmex. Género Acromyrmex.

Género Acromyrmex. Género Acromyrmex.

Género Atta Atta. Género Atta. Género

Género Atta. Género Atta.

Atta cephalotes Atta cephalotes (Linnaeus, 1758). Acromyrmex octospinosus (Reich, 1793). Atta cephalotes  3 pares de espinas dorsales  4 o 5 pares d espían dorsales.  lóbulos 3 pares de espinas  4 o 5 pares d espían dorsales.  dorsales de 1 espina en los lóbulos  Muchas espinas en los  4 oMuchas 5 paresespinas de espinas dorsales  3 paresNo demás espinas dorsales de la cabeza laterales  No más de 1 espinalaterales en los lóbulos en los lóbulosde la cabeza.  Abdomen con sedas superficie  Abdomen con sedas engrosadas, laterales de la cabeza laterales de la cabeza.  Muchas espinas en lossuperficie lóbulos irregular, laterales con de  No más depuede 1 espina enylos lóbulos lisa, ser opaca o brillante.  Abdomen con sedas y superficie  Abdomen con sedas engrosadas, Atta cephalotes Atta cephalotes tubérculos y siempre opaca. la cabeza laterales la cabeza lisa, puede ser opaca ode brillante. superficie irregular, con Notable diferencia de tamaño entre  3 pares de espinas dorsales Poca de tamaño entre  4o 5 pares dy espían  3pares de espinas dorsales 4 o 5dorsales. pares ddiferencia espían dorsales. tubérculos siempre opaca. castas. castas.   Abdomen con engrosadas, diferencia Abdomen sedas y superficie lisa,   No más de 1espina en lóbulos No más decon 1 espina Muchas espinas en lóbulos  sedas Muchas espinas en los lóbulos Notable de los tamaño entreen los lóbulos Poca diferencia delos tamaño entre  Obreras miden 1.5 cm.  Obreras miden entre 0.8-1.0 cm. laterales de la cabeza cabeza laterales la cabeza. laterales la cabeza. castas. de lapuede castas. de superficie irregular, condetubérculos y  laterales ser opaca o hasta brillante  sedas Abdomen con  sedas Abdomen con sedas con y 1.5 superficie   Abdomen engrosadas,  Abdomen Obreras miden hasta cm. sedas y superficie Obreras con miden entre 0.8-1.0 cm. engrosadas, lisa, puede ser opaca o brillante. superficie lisa, puede ser opaca o brillante. siempre opaca superficie irregular, con irregular, con tubérculos y siempre opaca. tubérculos y siempre opaca.   Poca diferencia de tamaño entre castas  Notable diferencia detamaño tamaño entre castas.  Notable diferencia entre  Poca diferencia de tamaño  entre Notable diferencia de tamaño entrede Poca diferencia de tamaño entre castas. castas. castas. castas.   Obreras entre 0.8miden – 1.0 cm 0.8-1.0   Obreras miden hasta1.5 1.5cm. cm Obreras miden  Obreras entre cm.  Obreras miden hasta 1.5 cm. hasta Obrerasmiden miden entre 0.8-1.0 cm.

 Entradas de forma cónica Montículos en forma cónica pronunciada. achatada.  Gran cantidad de tierra excavada en Poca tierra excavada en el  Entradas de forma cónica Montículos en forma conglomerado cónica el conglomerado central central. pronunciada. achatada.  Actividad intensa.  Escasa actividad visible.  Gran cantidad de tierra excavada eninternas. Poca tierra excavada en el cámaras internas.  Muchas cámaras  Pocas el conglomerado conglomerado central.  central Profundidad de las cámaras de hasta  Profundidad de las cámaras de  Actividad intensa. 3 metros. Escasa actividad visible. hastaen 1 metro.  Entradas de forma cónica  Montículos forma cónica 

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 Muchas cámaras internas. Pocas cámaras internas. pronunciada. achatada.  Montículos en de forma cónica achatada.  Entradas de forma cónica pronunciada. achatada.  pronunciada. Profundidad las cámaras de Profundidad las tierra cámaras de  de Gran cantidad dehasta tierra excavada en  Poca excavada en el  Gran cantidad de tierra excavada en  Poca tierra excavada en el 3 metros. hasta 1 metro. el conglomerado central conglomerado central.  Poca tierra excavada  Gran cantidad de tierra excavada en el central conglomerado central.en el conglomerado el conglomerado  Actividad intensa.  Escasa actividad visible.  Actividad intensa.  central. Escasa actividad visible. conglomerado central.  Muchas cámaras internas.  internas. Pocas cámaras internas.  Muchas cámaras internas.  Pocas cámaras  Actividad Profundidad de las cámaras de hasta  Profundidad de las cámaras de   Escasa actividad visible.  intensa.  Profundidad de las cámaras de hasta Profundidad de las cámaras de 3 metros. hasta 1 metro. 3 metros. hasta 1 metro.  Pocas cámaras internas.  Muchas cámaras internas.  Profundidad de las cámaras de hasta 1  Profundidad de las cámaras de hasta 3 metro. metros.

Montículos en forma cónica

Entradas de forma cónica

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3.3.1 Descripción del género Atta. El género Atta se caracteriza por ser hormigas grandes, generalmente de color oscuro, peludas, con tres espinas en la parte superior del cuerpo, se considera que estas estructuras espinosas pueden ayudarlas a prevenir la oviposición de las moscas parásitas (Diptera: Phoridae) y a evitar la depredación. Sus hormigueros son muy profundos y extensos en área, con abundante población de hormigas (se ha reportado hasta 12 millones de hormigas en un hormiguero maduro) y posee castas de soldados. El hormiguero es muy visible al igual que los caminos de acceso que son fácilmente identificables. Se han reportado hormigueros de Atta de 500 metros cuadrados de área y 15 metros de profundidad. Generalmente en un hormiguero maduro se pueden encontrar bocas independientes de salida y entrada de las hormigas. Este género es muy agresivo y atacan gran variedad de cultivos causando graves daños, entre los que encontramos más frecuentemente: frutales, hortalizas, café, plátano, yuca, maíz, fríjol, caña, forestales, entre otros. (Escobar-Durán, 2002; Herrera et al., 2011; Vergara-Castrillón, 2005).

Las mandíbulas de Atta y Acromyrmex son apéndices cefálicos que les sirven para manipular sus alimentos y defenderse. Con ellas pueden cortar y transportar los materiales vegetales frescos, podar las hifas del hongo simbionte, mover y limpiar las crías y construir túneles y recámaras (Herrera et al., 2011). Otra característica de estás hormigas es su sistema salival el cual está conformado por diferentes glándulas: la pos-faríngea, la hipo-faríngea, la mandibular y las salivares. A pesar de su posición, la función de estas glándulas no solo está limitada a la digestión, si no también son la fuente de antisépticos (Herrera et al., 2011), las secreciones de las glándulas mandibulares reducen la propagación de microorganismos contaminantes (Pavón et al., 2006). Las glándulas salivares, al igual que la glándula metapleural, están relacionadas con la comunicación, la diferenciación y el reconocimiento de los individuos de la colonia (Do Amaral y Machado-Santelli, 2008).

Para este estudio se trabajó con la especie: Atta mexicana (F. Smith), que se caracterizan por ser cultivadoras de hongos que utilizan para alimentarse. Para el cultivo de

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los hongos las hormigas proveen un sustrato de materia vegetal fresca, que en muchas ocasiones provienen de huertos y cultivos, por lo que son consideradas como plaga (Marquez-Luna et al., 1994).

De las tres especies de Atta que se encuentran en México, A. mexicana es la de más amplia distribución; y se ha colectado en los estados de Aguascalientes, Distrito Federal, Durango, Guanajuato, Guerrero, Hidalgo, Jalisco, México, Morelos, Nayarit, Nuevo León, Puebla, Querétaro, San Luis Potosí, Sinaloa, Sonora, Tamaulipas, Veracruz y Zacatecas. Fuera de México su distribución se extiende hasta Honduras, Guatemala y el Salvador y se conoce únicamente de una localidad de los Estados Unidos, en el estado de Arizona. Tiene un amplio rango de tolerancia a diferentes ambientes, ya que viven en zonas áridas, en bosque nublado, en selva alta perennifolia y en encinares, y se encuentra desde el nivel del mar hasta los 2200 m de altitud (Rojas, 1989).

3.3.2 Formación del hormiguero y el jardín de hongo. El hormiguero es creado en las épocas de lluvias que corresponden a los meses de abrilmayo y septiembre-noviembre. Antes de entradas estas épocas, salen de su hormiguero maduro aproximadamente 15.000 hormigas aladas (5.000 hembras aladas y 10.000 machos alados), los cuales realizan el vuelo nupcial con el fin de garantizar la procreación y supervivencia de la especie, donde las hembras son copuladas por 7 a 8 machos. De las cuales solo sobrevive un porcentaje del 2 al 4 %, las que logran enterrarse y formar un nuevo nido u hormiguero (Vergara-Castrillón, 2005).

Después del vuelo nupcial, la reina fecundada en 6 - 8 horas excava el canal y cámara inicial. (Vaccaro et al., 2004). La nueva reina, quien formara el nuevo hormiguero, lleva en su cavidad bucal conocida como micango una pequeña porción de micelio del hongo del hormiguero madre, el cual, a las 48 horas de excavar degluten en su nuevo nido (riega con sus heces) y de esta manera propagan eficazmente el hongo. Mientras el hongo crece, la reina a los 4 - 6 días inicia la postura de huevos, colocando varias clases, unos que son utilizados para su alimentación de la pequeña colonia mientras sale al exterior y otros

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huevos que dan origen a las obreras. Durante 90 días alimenta su prole con huevos de alimentación. A los 52 - 60 días del vuelo nupcial salen las primeras pupas y adultos. El hongo presenta forma de pequeñas bolitas (es el único alimento de las obreras). Las larvas son alimentadas con los huevos de alimentación (solamente cuando el jardín de hongo es grande pasa a ser alimento del hormiguero). Posteriormente las obreras construyen el hormiguero hasta que la colonia emerge al exterior para cortar pedazos de plantas (a partir de este momento el jardín de hongo es cultivado con hojas). El desarrollo completo del hormiguero dura 3 años para el género Atta y 2 para Acromyrmex, en este momento se produce la primera producción de machos y hembras alados (Currie et al., 1999; Vaccaro et al., 2004, Vergara-Castrillón, 2005). Cada reina puede poner 1, 500, 000 huevos al año. Las colonias de Atta pueden durar más de 30 años, con una sola reina reproductiva (Currie et al., 1999; Currie, 2001).

Estas hormigas construyen nidos especiales, regulando las condiciones de humedad, temperatura y concentración de dióxido de carbono y evitando la contaminación por otros hongos y bacterias, gracias a secreciones antibióticas de sus glándulas metapleurales. El nido maduro (Figura 4), consta de una galería central de la cual se desprenden múltiples galerías pequeñas que conducen a las cámaras donde esta hormiga cultiva su hongo simbionte (Jaffe, 1993). En los hormigueros se distinguen varias clases de cámaras: cámaras vivas, donde se encuentra el jardín del hongo; cámara real: donde se encuentra la reina; cámaras vacías, las recién construidas o desocupadas después de ser usadas. Cámaras de basura o de desechos donde se acumula el hongo senescente, el material vegetal agotado y hormigas muertas o enfermas (Escobar-Durán, 2002).

Figura 4. Esquema de un corte transversal de un nido de Atta, con las galerías que terminan en las cámaras de cultivo del hongo. Las galerías más anchas sirven de ducto de ventilación. (Jaffe, 1993).

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La actividad de una colonia de hormigas arrieras puede dividirse en tres etapas: el corte y acarreo de material vegetal, el cultivo de hongos y la eliminación de desechos. 

Corte y acarreo de material vegetal. Las hormigas obreras cortan fragmentos de hojas tiernas y suculentas u hojas completas con alto contenido de nutrimentos y bajo en compuestos potencialmente peligrosos para el cultivo de hongos (Rockwood, 1976; Garling y Rettenmeyer, 1978; Mintzer, 1979; Cherrett, 1983; citado de: Fortanelli-Martínez et al., 2001). El corte y traslado de hojas presenta una alternancia estacional: nocturno durante el verano y diurno en el invierno (Mintzar, 1979; Wetterer, 1990; citado de: Fortanelli-Martínez et al., 2001).



Cultivo de hongos. En el hormiguero, las hojas son limpiadas, raspadas y cortadas en piezas de 1 a 2 mm de diámetro. Posteriormente son masticadas y se les añade saliva y líquido anal, este último es rico en compuestos nitrogenados como alantoína, ácido alantoico, amonio y 21 aminoácidos (Wilson, 1971; Stevens, 1983; citado de: Fortanelli-Martínez et al., 2001). Una vez preparado, el material vegetal se coloca en cámaras donde sirve como sustrato para el desarrollo de un basidiomiceto (Leucocoprinus gongylophora). En dicho sustrato, las obreras insertan racimos de micelio; al cabo de 24 h, el sustrato se ve cubierto, casi totalmente, por el hongo. El alimento de las hormigas son unas protuberancias esféricas o elipsoidales llamadas gongylidias, las cuales se desarrollan en las puntas de las hifas, de donde las obreras las cortan (Wilson, 1971; Stevens, 1983; citado de: Fortanelli-Martínez et al., 2001)



Eliminación de desechos. Cuando los hongos concluyen su ciclo vital y el sustrato vegetal agota su valor nutrimental, ambos se llevan hacia depósitos de desechos; allí también se lleva a las hormigas muertas (Wilson, 1971; Haines, 1978; Stevens, 1983; citado de: Fortanelli Martínez et al., 2001). Los depósitos o vertederos de desechos pueden estar confinados en cavidades especiales dentro del hormiguero o fuera de él, como en A. mexicana (Haines, 1978; Deloya, 1988; citado de: Fortanelli-Martínez, et al., 2001).

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3.3.3 Organización social. En el nido cada hormiga tiene una función que desempeñar dentro del hormiguero y está ligado a su tamaño, recibiendo nombres específicos, que diferencian sus “castas”: 1. Exploradoras: son las que exploran los terrenos y seleccionan las plantas a cortar (Vergara-Castrillón, 2005). Para esto tienen un órgano ubicado entre el post-pecíolo y el gáster, llamado comúnmente órgano estridulador o chirriador, que permite a las obreras causar alerta en sus congéneres de la colonia, para invitar a las compañeras, a que utilicen el material vegetal ya identificado (Hölldobler y Wilson, 1996, citado de: Yepes et al., 1999). 

Cortadoras: son las que cortan las partes de las plantas. Tienen mandíbulas grandes.



Cargadoras: son las que cargan los pedazos de las plantas al hormiguero.

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Escoteras: son las que limpian los pedazos de plantas cortados, con el fin de evitar la entrada de otros insectos y cuerpos extraños dentro del hormiguero.



Jardineras: se encargan de cuidar el hongo y fraccionar en pedazos más pequeños las partes de las plantas, de las cuales se alimenta el hongo. También son encargadas de alimentar boca-boca y boca-ano a toda la colonia incluyendo a la Reina, además de cuidar los estados inmaduros



Soldados: son los encargados de defender el hormiguero. Son las hormigas que tienen la cabeza más grande u poseen mandíbulas muy fuertes.

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Machos alados: son los encargados de copular las hembras aladas cuando se realiza el vuelo nupcial. Después de copular mueren.

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Hembras aladas: son las encargadas de la procreación y permanencia de la especie. Si sobreviven a depredadores forman su propio hormiguero, convirtiéndose en una reina.

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Reina: es la que gobierna en su hormiguero. Solo existe una reina por hormiguero y es la de mayor tamaño en todo el nido.

(Vergara-Castrillón, 2005).

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3.3.4 Clasificación y recolección del material vegetal. Las hormigas cortadoras de hojas poseen el hábito de cortar y transportar diversos fragmentos vegetales a sus nidos subterráneos para el cultivo del hongo simbiótico (Valmir et al., 2004).

Dada la compleja organización social de Atta, existe una dieta diferente para cada uno de ellos: los adultos requieren de dietas ricas en carbohidratos, las cuales obtienen de la savia de las plantas que cortan, mientras que las larvas requieren de dietas ricas en proteínas para su crecimiento, que se las proporciona el hongo que cultivan las obreras (Bertorelli et al., 2005). La alimentación de estas hormigas se considera monófaga porque se nutren, mayoritariamente, del hongo simbionte que cultivan (a su vez son micófagas), el cual se encarga de metabolizar los polisacáridos de las plantas que recolectan (Siqueira et al., 1998, Erthal et al., 2008; Kooij et al., 2011 y Moller et al., 2011 citado de: Herrera et al., 2011). Sin embargo también son polífagas por que incorporan a su dieta savia y los fluidos extracelulares de las plantas (monocotiledóneas y dicotiledóneas) mientras cortan sus partes preferidas (Pintera, 1983; Farji-Brener, 2001 y Urbas et al., 2007 citado de: Herrera et al., 2011).

Debido a que el hongo simbiótico es la única fuente de alimento de las larvas de hormiga cortadoras, estas deben cultivarlos con hojas que posean características que permitan su adecuado crecimiento, por lo que escogen follaje rico en agua, nitrógeno y fósforo, pero bajo en fibra (Berish, 1986; Barone y Coley, 2002, citado de: Rodríguez et al., 2008) y manganeso ya que este elemento interfiere con la actividad metabólica del hongo simbionte (Berish, 1986 citado en: Rodríguez et al., 2008). Está bien establecido que la selección del material vegetal que cosecha las hormigas cortadoras de hojas depende tanto de las características físicas y químicas de la planta. Un experimento de laboratorio con las colonias de Atta y Acromyrmex, por Ridley y sus colaboradores demostraron que la hormiga aprende a rechazar los materiales vegetales que contienen productos químicos nocivos para el hongo (Hölldobler et al., 2011).

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Gomes De Siqueira et al., (1998) demostraron que las hormigas del género Atta y Acromyrmex no se alimentan del material sólido del vegetal pero que utilizan en su lugar los nutrientes líquidos reunidos de las hojas cortadas y del hongo. El hongo funciona como intermediario en la asimilación de polisacáridos de las plantas, de los que encontramos glucosa, xilosa, maltosa, celulosa y peptonas (Gomes de Siqueira et al., 1998).

3.3.5 El hongo y su relación simbiótica. La comprensión de este mutualismo se ha visto obstaculizada en gran medida por la falta de información sobre la ubicación taxonómica y la historia evolutiva de los cultivos fúngicos. Los métodos tradicionales para la taxonomía y sistemática de los hongos depende de la morfología de las estructuras fructíferas, sin embargo, el hongo cultivado por las hormigas Attini no producen fácilmente estas estructuras (Currie, 2001).

El primer informe del hongo simbiótico se remonta a 1874 cuando Thomas Belt descubrió la razón de forrajeo de las hormigas (Escobar et al., 2002). Posteriormente Moller en 1895 investigó el hongo cultivado por las hormigas del género Acromyrmex y lo clasificó como Rozites gongylophora. En 1938 Sthael y Kintzel, de manera individual, concluyeron que el hongo cultivado por varias especies de Atta podría ser R. gongylophora; sin embargo, no había acuerdo entre otros investigadores (Pérez, 1947; citado de: HerreraSalazar, 2009). Actualmente se clasifica en: Phylum Basidiomycota, clase Agaricomycetes, orden Agaricales y familia Agaricaceae (Index Fungorum, 2008).

Existen distintas hipótesis sobre el origen de los hongos asociados a estas hormigas. Algunas sostienen que evolucionaron de antecesores saprofíticos como los que se encuentran en depósitos de semillas, madera putrefacta y cuerpos de artrópodos; otras, postulan que provienen de hongos micorrícicos de algunas especies vegetales (Garling, 1979; citado de: Lugo et al., 2013).

Los hongos cultivados se caracterizan por producir unas estructuras especializadas llamadas gongylidia, de las cuales las hormigas se alimentan, llamando al conjunto de

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gongylidias, staphylae (Figura 5). Las gongylidias son inflamaciones de hifas ricas en lípidos e hidratos de carbono (Currie, 2001) de forma elipsoidal, de 30 - 50 µm de diámetro (Hölldobler et al., 1990). Este hongo presenta hifas sin conexión de fíbulas y septo dolíporo, el parentosoma es de estructura poreada, con pequeños poros, de tamaño y espacios regulares. (Mohali, 1998). Las estructuras son ricas en glicógeno e hidrolasa, en una forma fácilmente asimilable por las hormigas; mientras que el micelio en sí tiene hidratos de carbono, aminoácidos libres, aminoácidos unidos a proteínas y lípidos (Hölldobler et al., 1990).

Figura 5. Conjunto de gongylidias, igual conocido como staphylae observada bajo un microscopio óptico. Cada una de las esferas corresponde a una gongylidia (1000X) (Schneuder y Odair, 2003, citado de: dos Santos et al., 2013).

Este organismo es cultivado por el género Atta como su fuente primaria de nutrientes. El hongo proporciona el alimento exclusivo de las larvas y una parte a las hormigas adultas, que son las encargadas de reproducir el hongo en el jardín (FernándezMarín et al., 2010). Para el efecto, las hormigas cortadoras cosechan material vegetal alrededor de la colonia y lo transportan a cámaras subterráneas donde el hongo mutualista es cultivado. En este lugar el material vegetal es macerado y masticado hasta una pulpa, al cual agregan gotitas fecales, para crear un medio de crecimiento apto para el hongo (Escobar et al., 2002; Ronhede et al., 2003), estas gotitas fecales contienen enzimas de las

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cuales se ha demostrado que son de origen fúngico (Ronhede et al., 2004), enzimas, que digieren el material vegetal para producir los nutrientes necesarios para la supervivencia de las larvas y las hormigas adultas (Quinlan y Cherrett, 1979; Bass & Cherrett, 1995; citado de: Silva-Pinhati et al., 2005). En breve, el hongo cultivado no puede persistir sin hormigas activamente cuidando del jardín, y, a la inversa, las hormigas no pueden persistir sin el cultivo del hongo (Van-Bael et al., 2011).

Este mutualismo antiguo depende de los comportamientos higiénicos de hormigas y a una serie de “salud pública” estratégicas, que van desde el deshierbe y las conductas de aseo para el despliegue de un arsenal diverso de los antimicrobianos (Van-Bael et al., 2011); es así como estas hormigas protegen al hongo de bacterias y micoparásitos, aplicando en este, sustancias antimicrobianas que ellas mismas secretan, las cuales eliminan entre el 75 y el 90 por ciento del microorganismo (Fernández-Marín et al., 2010). En 1970, Ulrich Maschwitz y colaboradores hicieron el descubrimiento de que las sustancias antibióticas que la hormiga proporciona al hongo, son producidas en sus

glándulas

metapleurales (Figura 7). Estos pares de estructuras glandulares se localizan en el lado cerca del extremo distal del segmento medio del cuerpo de la hormiga llamado mesosoma o alitrunk. Ellos sugirieron que los compuestos juegan papeles diferentes en la purificación del cultivo del hongo simbiótico: el ácido fenilacético suprime el crecimiento bacteriano; myrmicacion (ácido hidroxidecanoico) inhibe la germinación de esporas de hongos extraños; y el ácido indol acético, una hormona vegetal que estimula el crecimiento micelial (Hölldobles et al., 2011).

Esta relación que se ha desarrollado ha llegado al grado de que el hongo pierda la capacidad de producir esporangios (Weber, 1972; citado de: Mohali, 1998). Por lo que se dice, que es aparentemente incapaz de formar cuerpos fructíferos y este es propagado en forma vegetativa en el interior de la colonia por las hormigas obreras. La respuesta del hongo en actividad es proliferar rápidamente como micelio (Weber, 1979; citado de: Mohali, 1998).

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3.3.6 Hongos y bacterias asociados a la simbiosis. Además de estos dos organismos simbióticos, se sabe que un grupo de microorganismos se pueden encontrar en asociación con el jardín de hongos de estas hormigas, tales como bacterias, levaduras y hongos filamentosos (Craven et al., 1970; Fisher et al., 1996; Pagnocca et al., 1996; Carreiro et al., 1997, citado de: Rodríguez et al., 2005).

Currie y colaboradores (1999) fueron los primeros en observar hormigas cubiertas de una bacteria filamentosa que posteriormente se identificó en el género Pseudonocardia. Estas bacterias que se hospedan en estructuras especializadas del exoesqueleto de las hormigas, además de promover el crecimiento de los jardines fúngicos, producen metabolitos secundarios, entre ellos antibióticos con potentes propiedades específicas inhibitorias del crecimiento de microorganismos que pueden contaminar el jardín y que las jardineras utilizan para mantener los cultivos del hongo simbiótico libres de contaminantes.

También se ha observado que las secreciones de las glándulas mandibulares reducen la propagación de microorganismos contaminantes. Según Pavón y Camargo (2006), los contenidos de estas glándulas pueden actuar como agentes bactericidas y fungicidas (Figura 6).

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Figura 6. A) Vista de la forma del crecimiento de la bacteria filamentosa Actinomycetous, que muestra el patrón de crecimiento típico y su espesor en la cutícula. Escala 10 µm. B) Vista de Streptomyces (flecha), en el marco de las patas delanteras de Apterostigma sp. este es el lugar característico de la bacteria en los géneros de Attini. Escala 100 µm. C) Vista ventral de una obrera de Acromyrmex. El Actinomiceto se puede ver justo debajo de cabeza, en el propleuron de la hormiga. Escala 500 m (Currie et al., 1999).

Aunque la diversidad de patógenos es elevada (se incluyen otros hongos y bacterias generalistas), destaca un hongo especialista (Escovopsis), que ataca a los hongos cultivados. En algunos linajes, las hormigas cultivan bacterias actinomycetes y usan sus productos metabólicos antibióticos para el control específico de Escovopsis. (Fernández-Marín et al., 2010).

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4. OBJETIVOS. 5.1 OBJETIVO GENERAL. 

Aislar cepas fúngicas de un jardín de hongo de Atta mexicana.

5.2 OBJETIVOS PARTICULARES. 

Aislar y purificar alguna cepa de Leucocoprinus gongylophora.



Aislar y purificar hongos relacionados al jardín de hongo Atta mexicana.



Identificar mediante claves taxonómicas los hongos aislados del jardín de hongo de Atta mexicana.

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5. HIPÓTESIS. Debido a que se ha reportado que los jardines de hongo del género Atta, tienen Leucocoprinus gongylophora, se pretende encontrar el aislamiento de esta especie, en los jardines de hongo de Atta mexicana.

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6. METODOLOGÍA. INECOL

LATEX/UV

• Obtención del material Biológico

• Mantenimiento del jardín de hongo

.

Selección del medio de cultivo Aislamiento de hongos. Identificación de los hongos aislados.

6.1 Obtención del material biológico (INECOL). El jardín de hongo de la hormiga en estudio, A. mexicana, fue proporcionado en el Instituto Nacional de Ecología (INECOL), por el Dr. Jorge Valenzuela, entomólogo especializado en hormigas, quien recientemente se encuentra trabajando con esta especie. En este lugar mantienen a la hormiga y por ende al hongo en terrarios artificiales, adaptados para su sobrevivencia, a una temperatura que oscila entre los 25 y 27 °C y luz blanca, excepto donde se encuentra el jardín de hongo que debe mantenerse en obscuridad.

Dos veces a la semana, se proporcionó hojas de Rosa sp., de algunos cítricos y/o hojuelas de Avena sp. como sustrato para el cultivo del hongo. Se mantuvieron aproximadamente de 10 a 12 nidos de esta especie con su debida reina cada uno, las cuales fueron atrapadas en los municipios de Coatepec y Teocelo, Veracruz a finales de las épocas de lluvia correspondientes al mes de mayo y principios de junio del

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2008, en las primeras horas de la mañana, después de haber realizado el vuelo nupcial. Las hormigas reinas son depositadas en frascos estériles y transportadas al INECOL, en donde las mantienen en obscuridad a una temperatura entre 25 y 27 º C (Figura 7).

Figura 7. Hormigas reinas antes de deglutir el hongo.

Después de los 7 días las hormigas reinas degluten el hongo que transportan en la cavidad bucal, conocida como micango, y comienzan a cultivarlo. Aproximadamente a los dos o tres meses cuando nacen las primeras larvas, el jardín de hongo junto con la hormiga reina y sus larvas, son traspasadas a un frasco de mayor tamaño, donde inicia el crecimiento de la colonia. Cuando crecen las primeras obreras al frasco donde se encuentra el jardín de hongo se le conectan con ayuda de mangueras, otro frasco, para depositar el sustrato vegetal con el cual será cultivado el hongo, dependiendo el crecimiento de la colonia se le van agregando otros frascos (Figura 8).

Figura 8. Colonia en el terrario artificial. INECOL.

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Tres de los 12 nidos mantenidos en el INECOL, escogidos al azar, fueron utilizados como fuente para la obtención del jardín de hongo. Fragmentos del hongo y algunas hormigas fueron retirados de cada uno de los nidos escogidos y se transfirieron en frascos previamente esterilizados, para ser transportados al laboratorio. El estudio fue realizado en el Laboratorio de Alta Tecnología de Xalapa.

6.2 Mantenimiento del jardín de hongo. Las muestras proporcionadas se transportaron al Laboratorio de Alta Tecnología de Xalapa en sus respectivos frascos estériles, en donde se mantuvieron en un cuarto obscuro a una temperatura controlada de 25-27 ºC. El transporte de algunas hormigas en las muestras elegidas, nos permitía mantener el jardín de hongo libre de patógenos y estimular su crecimiento. Una vez a la semana se les proporcionaba materia vegetal fresco de Rosa sp. o cítricos, para que las hormigas obreras continuaran con el cultivo de este.

6.3 Selección del medio de cultivo. Para el cultivo in vitro se probó con cámaras húmedas y medio MEA y PDA. Esto con el fin de seleccionar el adecuado para el crecimiento de L. gongylophora y los hongos asociados al jardín.

6.3.1 Desinfección del material biológico. Esta técnica fue utilizada con el objetivo de eliminar gran parte de los contaminantes y conservar el micelio del hongo, este proceso de desinfección, se llevó a cabo en la campana de flujo laminar, el cual consistió, en sumergir con una pinza, previamente desinfectada con etanol industrial, un fragmento de la muestra en agua destilada, luego en hipoclorito al 4 % y por último en agua estéril. Este método se utilizó antes de inocular la muestra proveniente del jardín de hongo, en los medios de cultivo.

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6.3.2 Medios de cultivo. 

Cámara húmeda. Esta práctica consiste en inocular dentro de una campana de flujo laminar, las muestras a analizar, en cajas estériles que contienen papel filtro el cual debe de mantenerse húmedo constantemente. Para esto se utiliza una pipeta Pasteur, con la que se agrega cada 24 h aproximadamente, agua estéril, esto con el fin de mantener el inoculo con una humedad adecuada y favorecer su crecimiento.



Agar Extracto de Malta (MEA) Otro de los medios probados fue un medio común nombrado Agar Extracto de Malta (MEA), el cual contenía: 

Agar bacteriológico……. 20 g/L



Extracto de malta………. 20 g/L



Polipeptona de carne...........5 g/L



Extracto de levadura……...2 g/L

Este medio se eligió basándonos en lo reportado por Miyashira et al., 2010 donde obtuvieron el crecimiento in vitro de L. gongylophora. 

Agar Dextrosa y Papa (PDA). El segundo medio de cultivo utilizado fue el de Agar Dextrosa y Papa (PDA), el que consiste en: Agar Dextrosa y Papa.........39 g/L.

Escogimos este medio por ser uno de los más comunes utilizados para el aislamiento de cepas fúngicas y su disponibilidad.

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6.4 Aislamiento de Hongos. A partir de los 3 jardines del hongo proporcionado por el INECOL, se realizaron los aislamientos del hongo en estudio, utilizando Medio MEA, PDA y cámara húmeda con 5 réplicas.

Tanto las cámaras húmedas como los medios de cultivo preparados fueron previamente esterilizados en autoclave a una temperatura de 121 ºC y una presión de 15 lb. Posteriormente en la campana de flujo laminar se humedeció con agua estéril, el papel filtro de las cámaras húmedas, utilizando una pipeta Pasteur. De igual forma, los medios de cultivo MEA y PDA fueron servidos en sus respectivas cinco cajas Petri, agregando aproximadamente 20 ml de estos en cada una.

Posteriormente en la campana de flujo laminar se tomó con una pinza estéril, una pequeña porción de cada uno de las tres muestras obtenidas, las cuales pasaron por el proceso de desinfección. Cada fragmento desinfestado, fue inoculado tanto en cámara húmeda como en los medios de cultivo, con la pinza esterilizada a la flama en el medio. Las cajas Petri inoculas se mantuvieron en obscuridad y a una temperatura de 25 a 27 °C, durante un intervalo de 7 a 15 días, realizando revisiones diarias.

Transcurrido este tiempo o al ver un crecimiento, las cajas Petri fueron observadas en el microscopio estereoscopio, para seleccionar el crecimiento micelial y descartar posibles bacterias o levaduras encontradas en el cultivo. Las hongos desarrollados, fueron nuevamente resembrados en el medio donde se pudo ver un mejor desarrollo micelial, con el fin de evitar la invasión de los contaminantes. Este procedimiento se llevó acabo hasta que los hongos se encontraron totalmente purificados.

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6.5 Identificación de los hongos aislados. Una vez purificada los hongos, se procede a identificarlas mediante resiembra en microcultivos y el examen directo con cinta adhesiva.

6.5.1 Siembra de microcultivos.

Para esta técnica se preparó una caja con el medio de cultivo elegido para el cultivo de las cepas, lo cual fue esterilizado a una temperatura de 121 ºC. Posteriormente en la campana de flujo laminar se vació el medio en la caja Petri, al cual, después de solidificarse se le realizó una fragmentación en cuadros (cubos) de aproximadamente 1x1 cm, con la ayuda de un bisturí. Luego se colocó una de las piezas cortadas del medio sobre un portaobjetos, previamente esterilizado. Se resembró en este, con un asa micológica estéril, la cepa a estudiar por los cuatro lados del medio, con la técnica de picadura y se tapó con un cubreobjetos, para después agregarlo a una caja Petri, la cual fue sellada con cinta adhesiva. Se incubó la muestra a una temperatura de 25 a 27 °C, por 7 días o dependiendo el desarrollo del hongo. Transcurrido este tiempo se observó en un microscopio compuesto a diferentes aumentos de 10, 40 y 100X.

6.5.1 Examen directo con cinta adhesiva (Scotch -tape).

Para esta metodología se tomó el hongo a identificar y dentro de la campana de flujo laminar, a un asa micológica esterilizada se le pegó un fragmento de cinta adhesiva transparente. Luego se introdujo el asa con la cinta a la caja Petri, donde se encontraba la cepa de hongo aislada, hasta tocar la colonia a investigar por la parte adhesiva de la cinta, teniendo cuidado a no presionar para no romper las estructuras.

Se desprendió el fragmento de cinta adhesiva, con la ayuda de una aguja de disección. Sobre un portaobjetos con una gota de colorante de azul de lactofenol se adhirió la cinta con la muestra tomada, sin presionar la parte donde se encontraban las estructuras.

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Se limpió con papel secante para retirar el exceso de colorante y se observó al microscopio compuesto a 10, 40 y 100X.

Después de haber realizo estas técnicas y observado al microscopio compuesto, se realizó la identificación con la ayuda de claves taxonómicas como fueron The Fusarium Laboratory Manual Leslie et al., 2006; Claves Taxonómicas de Gómez de Membrilla 1950 entre otras, basándonos en la forma y tamaño de sus estructuras; como evidencia se tomaron fotografías de los hongos observados.

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7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. 7.1 Selección del medio de cultivo. Para el aislamiento de la L. gongylophora, se buscó un medio de cultivo, con los nutrientes necesarios para su crecimiento. De los tres medios probados se observó

un mayor

crecimiento en el medio MEA, comparado con el cultivo realizado en PDA y en las cámaras húmedas. Durante el cultivo hubo desarrollo de hongos con diferentes características macroscópicas. En la Tabla 1 se muestra la medición cualitativa del crecimiento de los hongos observados, basándose en la dimensión radial de la colonia, al cabo de 15 días.

Tabla 3. Crecimiento de hongos en diferentes medios de cultivo.

Medios de cultivos

Cámaras

MEA

PDA

Fusarium sp.

++++

++++

---

Penicillium sp.

++++

++++

+++

Geotrichum sp.

++++

++++

++

+++

++

+++

Géneros.

Leucocoprinus gongylophora

húmedas

Basándonos en lo descrito en la tabla anterior, se pudo observar que a pesar de que los géneros Fusarium sp., Penicillium sp. Geotrichum sp. tuvieron un crecimiento similar en los medios MEA Y PDA, Leucocoprinus gongylophora mostró un desarrollo menor en PDA. En las cámaras húmedas no se observó crecimiento mayor que en los dos medios anteriores, por lo que fue descartado. De acuerdo a lo anterior se decidió utilizar el medio MEA para el cultivo in vitro de los hongos, por mostrar mayor crecimiento en todos los hongos encontrados, y por lo reportado en Miyashira y colabradores, 2010 quienes obtuvieron el crecimiento in vitro de L. gongylophora en un medio similar a este.

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7.2 Aislamiento de las cepas fúngicas. El medio elegido fue MEA donde se realizó el aislamiento de los hongos de los cuales se aislaron siete y fueron agrupados en 4 géneros tomando en cuenta sus estructuras macroscópicas y microscópicas. A continuación, se muestra una tabla de los hongos encontrados en los distintos jardines de hongos proporcionados por el INECOL.

Tabla 4. Hongos encontrados en los tres jardines de hongo de Atta mexicana, proporcionados en el INECOL.

Jardín de hongo Géneros

Jardín 1

Fusarium sp.

Jardín 2

x

Penicillium sp. Geotrichum sp.

Jardín 3

x x

x

Leucocoprinus gongylophora

x

x

x

En la tabla anterior podemos observar que los aislamientos de Fusarium sp. solo fueron hallados en las muestras pertenecientes al jardín 1, de igual forma Penicillium sp. fue encontrado únicamente en el jardín 3. Geotrichum sp. se encontró en los jardines 1 y 3 y Leucocoprinus gongylophora pudo ser aislado de los tres jardines proporcionados.

A continuación se muestran los aislamientos fúngicos que se obtuvieron de las muestras en estudio identificados en género basándonos en sus características macroscópicas y microscópicas.

De la primer muestra aportada por el INECOL se obtuvieron cinco aislamientos fúngicos, pertenecientes a los géneros Fusarium sp, Geotrichum sp. y a Leucocoprinus gongylophora. El primero de ellos mostraba apariencia física algodonosa, de un color blanquecino, debido a estas características fue identificado en el género Fusarium sp. (Figura 9).

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Figura 9. Aislamiento fúngico 1 del género Fusarium sp., aislado del nido 1. Fotografía tomada a los 15 días de cultivo.

El segundo mostraba una apariencia algodonosa, con una coloración anaranjada a los 7 días de cultivo, la que fue desapareciendo a los pocos días de su crecimiento, quedando con una coloración beige con pequeñas manchas amarillas, de igual forma debido a estas características fue identificado en el género Fusarium sp. (Figura 10).

Figura 10. Aislamiento fúngico 2, género Fusarium sp., aislado del nido 1. Fotografía tomada a los 15 días de cultivo.

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Una tercera cepa fúngica fue aislada donde se observó una línea obscura alrededor del centro de la caja, que incluso mostraba una apariencia algodonosa y coloración blanquecina, con un crecimiento rápido, debido a estas características fue identificado en el género Fusarium sp. (Figura 11).

Figura 11. Aislamiento fúngico 3, género Fusarium sp., aislado del nido 1. Fotografía tomada a los 15 días de cultivo.

De acuerdo a Cárcamo-Rodríguez (2012) y Seifert, (2001) agrupamos a estos tres aislamientos fúngicos en el género Fusarium debido a su coloración micelial la cual puede ser blanco, rosado pálido, rojo, anaranjado, púrpura, celeste, verde aceituna o pardo, especialmente en el reverso de la colonia, excepto pardo obscuro o negro y a su apariencia que puede presentarse con un micelio ralo o denso, ya sea algodonoso, como un fieltro o con una zona central de funículos, pero en algunos casos es limoso.

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De igual forma, se aisló una cuarta cepa fúngica clasificada en el género Geotrichum, basándonos en su morfología macroscópica y en lo reportado en Agrios (2005). Ya que presentaba una coloración cremosa y apariencia viscosa (Figura 12). Cabe señalar, que este aislamiento fúngico fue encontrado en el primer y tercer jardín de hongo, y en la materia orgánica desechada por la hormiga.

Figura 12. Aislamiento fúngico 4, género Geotrichum sp., aislado del nido 1 y 3. Fotografía tomada los 15 días de cultivo.

El quinto aislamiento fúngico fue hallada en los tres jardines de hongo de Atta mexicana. Mostró una morfología rugosa y seca, con una coloración blanquecina en el centro. Su crecimiento era lento, y en forma vertical (Figura 13). La presencia de esta cepa en los distintos jardines de hongo, permite pensar que estamos hablando de L. gongylophora. De los distintos aislamiento que se han realizado de este organismo podemos mencionar el realizado por Silva-Phinati y colaboradores (2005) quienes mencionan la presencia de elevaciones blanquecinas en el cultivo in vitro de L. gongylophora. Comparando las imágenes mostradas en dicho estudio con la imagen presentada a continuación podemos confirmar las características mencionadas por SilvaPhinati (2005).

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Figura 13. Aislamiento fúngico 5, Leucocoprinus gongylophora, aislado del nido 1, 2 y 3. Fotografía Tomada a los 30 días de cultivo.

De esta manera, en el tercer jardín de hongo proporcionado se aislaron dos cepas fúngicas, identificadas como Penicillium sp. La primera de ellas presentaba una coloración verde obscuro. Con micelio aéreo, y crecimiento rápido. A los cinco días presentaba crecimiento micelial (Figura 14).

Figura 14. Aislamiento fúngico 6, Penicillium sp., aislado del nido 3. Fotografía tomada a los 7 días de cultivo.

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La segunda cepa aislada, fue identificada como Penicillium sp. mostraba una coloración obscura, con tonalidades claras. Presentaba un micelio aéreo y crecimiento rápido, al cuarto día presentaba crecimiento micelial (Figura 15).

Figura 15. Aislamiento fúngico 7, Penicillium sp., aislado del nido 3. Fotografía tomada a los 7 días de cultivo.

Estas dos cepas se agruparon en el género Penicillium por lo reportado en Carrillo (2003), quien menciona que las colonias de este género se presentan de forma circular, las cuales pueden ser aterciopeladas o algodonosas, con una coloración amarilla, anaranjada, púrpura o parda.

7.3 Identificación de las cepas fúngicas. De las pruebas realizadas se obtuvo la identificación de siete aislamientos fúngicos, los cuales son cepas pertenecientes a hongos filamentosos, levaduriformes y el hongo asociado al jardín de hongo de las hormigas del género Atta. De esta manera, de los tres jardines de hongo se logró obtener, aislar y purificar a Leucocoprinus gongylophora, hongo del cual se alimentan dichas hormigas, de igual forma, se obtuvo Geotrichum sp. 3 aislamientos del género Fusarium sp. y 2 aislamientos de Penicillium sp.

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7.3.1 Fusarium sp. Link (1809). Pertenece al reino Fungi, Phylum Ascomycota, clase Sordariomycetes, orden Hypocreales y familia Nectriaceae (Index Fungorum 2008). Booth (1917), citado en Carrillo 2003, menciona que la forma y tamaño de las esporas es la característica principal para el reconocimiento de los fusarios. Presentan esporas dispersas en el micelio aéreo o en esporodoquios o masas limosas (pionotos). Los macroconidios son curvados, pluriseptados, con una célula apical más o menos puntiaguda y en muchas especies con una célula basal en forma de pie. Los microconidios son comúnmente unicelulares, elipsoidales, fusiformes, claviformes, piriformes o subglobosos, similares en ancho a los macroconidios, con una base redondeada o truncada, por lo general formando cabezuelas mucosas, pero en algunas especies en cadenas basípetas. No siempre son producidos ambos tipos de esporas. Los conidióforos del micelio aéreo en algunos casos sólo constan de una célula conidiógena, en otros están ramificados, a veces en verticilos. Las monofiálides producen conidios desde una sola abertura y en las polifiálides surgen las esporas desde más de una abertura en la misma célula.

Basándose en lo descrito anteriormente y en las características morfológicas reportadas por Cárcamo-Rodríguez (2012) y en The Fusarium Laboratory Manual Leslie y colaboradores, (2006) para diferenciar especies de Fusarium. Pudimos observar en el microscopio óptico la presencia de macroconidias curvados, pluriseptados, con las presencia de un pie basal, las cuales son algunas características principales de este género (Figura 16). Las tres especies aisladas de este género, pertenecen al jardín 1.

40

a

b

c

Figura 16. Macroconidias. Imagen a) de la cepa fúngica 1; Imagen b) de la cepa fúngica 2; imagen c) de la cepa fúngica 3. Pertenecientes Fusarium sp. Vista al microscopio óptimo 100X.

Este género de hongo se encuentra ampliamente distribuido en el suelo, plantas y diferentes sustratos orgánicos (Alastruey-Izquierdo et al., 2008). Se conoce contiene muchos hongos patógenos de plantas, seres humanos y animales (Leslie et al., 2006). Por lo reportado por Alastruey- Izquierdo y colaboradores (2008) y por Leslie y colaboradores (2006), podemos asociar la presencia de estos organismos en el jardín de hongo, por la

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frecuencia con la que se hayan en la materia vegetal y por ser este, uno de los componentes principales del sustrato, para el cultivo de L. gongylophora

7.3.2 Penicillium sp. Link (1809). Perteneciente al Reino fungi, al Phylum Ascomycota, a la Clase: Ascomycetes, al orden Eurotioales y a la familia: Trichocomaceae (Index Fungorum, 2008). Las especies del género Penicillium son abundantes y frecuentes en la Naturaleza (Gómez de Membrillera, 1950). Este género se caracteriza por formar conidios en una estructura ramificada semejante a un pincel que termina en células conidiógenas llamadas fiálides. Si hay sólo un verticilo de fiálides el pincel es monoverticilado. Las ramificaciones de un pincel poliverticilado son ramas, rámulas, métulas y fiálides. Los conidios generados en fiálides suelen llamarse fialoconidios para indicar su origen. En la fiálide, al dividirse el núcleo, se extiende simultáneamente el extremo apical que luego se estrangula separando a la espora recién formada. Se llama conectivo a la porción de pared que une entre sí a los conidios permitiendo la formación de cadenas, y en algunas especies se aprecia claramente con el microscopio óptico (Webster, 1986, citado de: Carrillo, 2003).

Para la identificación de este género nos basamos en la clave taxonómica de Gómez de Membrillera 1950, y pudimos observar en el microscopio óptico, la forma de los conidios en sus estructuras ramificadas, conocidas como fialides, característicos de este género. En la primera cepa fúngica podemos observar fialides monoverticiladas (figura 17) y en la segunda se observan fialides terverticiladas (figura 18).

Figura 17. Fialides monoverticeladas. Aislamiento fúngico 7, Penicillium sp., del jardín 3. Microscopio óptico, vista 100X.

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Figura 18. Fialides terverticilados. Aislamiento fúngico 6, Penicillium sp., del jardín 3. Microscopio óptico, vista 100X.

Los hongos pertenecientes a los género Fusarium y Penicillium son considerados hongos saprófitos de plantas, y llegan a parasitar las hojas de algunos cítricos y Rosas sp., hojas con las cuales, en este caso, L. gongylophora es cultivado. Por lo que se cree que la presencia de estos organismos en el jardín de hongo de hormiga sea debido a la frecuencia con la que estos géneros de hongos se pueden encontrar en la materia vegetal. Existen reportes que a pesar de los métodos de limpieza que ocupan las hormigas de este género y la aportación de antibióticos que secretan de sus glándulas metapleurales, se ha demostrado que algunos hongos filamentosos, se encuentran todavía presentes en este entorno y que estos no causan ningún impacto negativo sobre el nido (Carlos et al, 2009).

7.3.3 Geotrichum sp. Link (1809). Perteneciente al reuni Fungi, al phylum Ascomycota, clase Saccharomycetes, oden Saccharomycetales, familia Dipodascaceae (Index Fungorum, 2008). Geotrichum es un hongo taxonómicamente situado en el límite entre levaduras y mohos típicos, es un microorganismo importante en la industria ago-alimentaria es un integrante de la parte de la microflora de algunos productos, se da también la biodegradación y la

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descontaminación y puede actuar como un contaminante (Gente, S. et al., 2006 citado de: Hernández-Montiel et al., 2011). El género Geotrichum está caracterizado por tener hifas estrechas con ramificaciones escasas y cortas. Presentan artroconidias con un tamaño promedio de 6-12 x 3-6 µm, unicelulares (Baruque, 2003). Comúnmente están asociados con los productos lácteos. Tiene esporas secas dispersas típicamente por aire. No tiene conidióforos. Las esporas se forman por la fragmentación de las hifas (artrosporas). Las esporas son hialinas, unicelulares, y variable en su longitud y anchura. Su tasa de crecimiento es rápida. Las colonias son planas, pulverulentas o cerosas, y son de color blanco. Puede causar alergia y reacciones asmáticas en personas sensibles. Es considerado un componente normal de la flora intestinal de los humanos. Se ha informado que varias especies pueden causar tracto intestinal, bronquial y las infecciones pulmonares (Caltex Mold Service, 1986).

Basándose en la información consultada, podemos identificar este hongo en el género Geotrichum. Debido a la presencia de artroconidias e hifas hialinas y la ausencia de conidióforos (Figura 19).

Figura 19. Hifas tabicadas, hialinas. Aislamiento fúngico 4, Geotrichum sp., del jardín 1 y 3. Vista 100X.

Se ha reportado la presencia de levaduras en el jardín de hongo de hormigas, y a pesar de que aún no está claro, se menciona su posible papel de detoxificación. Por lo que podría

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suponer que la presencia de este hongo por ser levaduriformes, encontrado tanto en el jardín de hongo, como en la materia orgánica desechada por la hormiga, pueda tener un papel mayor al pensado, y que pueda desempeñar la detoxificación de los compuestos disponibles en el jardín de hongo, lo cual Mendes y colaboradores 2012 han observado pueden ser perjudiciales para las hormigas.

7.3.4 Leucocoprinus gongylophora (Möller) Dörfelt & Creutzb Hongo de interés, para este investigación, perteneciente al reino Fungi, Phylum Basidiomycota, clase Agaricomycetes, orden Agaricales y familia Agaricaceae (Index Fungorum, 2008). Las hifas del hongo forman en sus extremos, grupo de inflado, comúnmente llamado gongylidia. (Weber, 1979, tomado de: Mohali, S., 1998). Este hongo presenta hifas sin conexión de fíbulas, septo dolíporo y abundantes gongilidos, característicos de estos hongos. Pudimos observar en el microscopio al conjunto de gongylidias (figura 20) y de la gongylidia (figura 21), aproximadamente a los 60 días de cultivo.

a

b

Figura 20. A) Staphilae= conjunto de gongylias, tomado de forma directa del jardín de hongo in vivo. B) Staphilae= conjunto de gongylias, tomado del aislamiento in vitro. Aislamiento fúngico 5, Leucocoprinus gongylophora, del jardín 1, 2 y 3. Vista a 100X.

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Las hormigas pertenecientes al género Atta, se dedican al cultivo de un hongo Basidiomyceto para su alimentación, con el cual cumplen una simbiosis mutualista obligatoria. Esta relación es tan estrecha, llegando al grado que el hongo ha perdido la capacidad de producir cuerpos fructíferos; estudio realizado por (Weber en 1972, citado en: Mohali 1998), que son las estructuras necesarias para la identificación taxonómica, es debido a esto que el estudio de este organismo se ha complicado y ha existido controversias sobre su posición taxonómica según lo mencionado por Pérez 1947, citado de: HerreraSalazar, 2009.

Figura 21. Gongylidia. Vista 100X.

De igual forma por no desarrollar estas estructuras el cultivo in vitro de L. gongylophora, es complicado. Aun existiendo estas dificultades se ha podido reproducir este hongo en el laboratorio. Por mencionar alguno de estos aislamientos nos encontramos con el realizado por Miyashira y colaboradores, quienes compararon el crecimiento radial de L. gongylophora en dos medios de cultivo, en este caso trabajaron con el medio MEA. Y pudieron observar que el medio MEA es más efectivo, comparado con otros medios. Este estudio fue realizado con la hormiga A. sexdens.

El cultivo in vitro de L. gongylophora, como el estudio mutualista entre las hormigas del género Atta y este hongo, se ha realizado con distintas especies de hormiga pertenecientes a este género, de las que encontramos ha A. cephalotes (Mohali, 1998), A. capiguara, A. laevigata (Silva-Pinhati et al., 2005), A. sexdens (Miyashira, 2010), A. texana y A. mexicana (Sánchez- Peña, 2005). En este último trabajo se ha estudiado la ecología de

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la hormiga A. mexicana, pero no se ha encontrado estudios sobre el aislamiento in vitro del hongo que cultivan.

En este trabajo se realizó el crecimiento in vitro del hongo que cultivan las hormigas A. mexicana, en el medio MEA, el cual mostró un crecimiento macroscópico, similar al aislamiento realizado por Silva-Phinati et al., 2005, y pudimos observar la presencia de gongylidias a los 60 días de cultivo. De los tres jardines de hongo proporcionados por el INECOL, se obtuvo el aislamiento de este hongo, en un 80% por cada uno de los jardines de hongo.

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8. CONCLUSIONES. Las características microscópicas y macroscópicas obtenidas de los cultivos aislados de nidos de A. mexicana coinciden con las de L. gongylophora aislado de los nidos de otras especies de este género, reportado en Silva-Phinati et al., 2005. En este caso en particular se aisló el hongo simbionte de tres jardines de hongo de Atta mexicana, del cual no existen reportes previos. Esta es la primera cita de L. gongylophora aislado de nidos de A. mexicana en nuestro país. Además, en este trabajo se demuestra que L. gongylophora, es la especie a la que se dedican las hormigas cortadoras de hongo a cultivar, pudiéndolo comprobar por la presencia de este en todos los medios cultivados, de las distintas muestras proporcionadas. A pesar de que se obtuvo el aislamiento de otros hongos asociados al jardín, estos encontrados en menor cantidad, podemos justificar la presencia de estos en el jardín de hongo, los que no son perjudícales para L. gongylophora, y de los cuales se puede obtener mayor información sobre su papel dentro del jardín, estudios aun no realizados a fondo. A partir de este trabajo también se pudo comprobar lo reportado en estudios anteriores, sobre la dificultad de la reproducción in vitro del hongo cultivado por las hormigas del género Atta.

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9. PERSPECTIVAS Y APLICACIONES Como una aplicación, con el apoyo del Instituto Universitario de Biorgánica “Antonio González” de la Universidad de la Laguna Tenerife España. Se obtuvo la actividad inhibitoria de los extractos de L. gongylophora en contra del quorum-sensing bacteriano.

9.1 Inhibición de Quorum-sensing. El cual fue determinado mediante la producción violaceina por C. violaceum CV026. El extracto de la biomasa de L. gongylophora, mostro una actividad inhibitoria del quorum sensing mayor al 65% en una concentración de 500 µg/ml. Con este método también se determinó que la reducción en la producción de violaceina es debido a un efecto de inhibición de quorum sensing y no de un efecto antibacteriano. Como parte de la aplicación, sabemos que el metabolismo de los hongos tiene efecto en el desarrollo de otros microorganismos, por lo que de acuerdo a los estudios realizados podemos concluir que existe la posibilidad que los hongos identificados interfieran en el quorum-sensing de ciertas bacterias. Esto podría deberse como parte de una evolución del hongo contra algunos organismos patógenos. Que a pesar de la protección que le brindan las hormigas, hayan tenido que desarrollar ciertos, métodos de protección para su sobrevivencia.

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identificación

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especies

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