Universidad Veracruzana

Facultad de Bioanalisis

“Manual de bioqulmica metabolica”

Presenta

Lidia Paola Diaz Nieto

Director

Laura Cecilia Gonzalez

Xalapa, ver.

Noviembre 2010.

Resumen

Este manual es un material de apoyo para la materia de bioquimica metabolica, que le brindara al alumno conocimientos vinculados teoria-laboratorio. Para la elaboracion del manual se eligieron diferentes practices con base en las secciones en la que este dividida como lo es: •

Metabolismo de carbohidratos

•

Ciclo de krebs

•

Cadena transportadora de electrones

•

Metabolismo de lipidos

•

Metabolismo de aminoacidos y acidos nucleicos

Ademas de que cuenta con un apartado de preparacion de soluciones y las reglas que se deben seguir eh el laboratorio

v

Manual de bioquimica metabolica 2010

Indice* I. Introduccion II. Justificacion

III. Objetivos

IV. Normas Generates del Laboratbrio. V. Manejo de RPBI

VI. Manual de Praciicas del Laboratorio de Bioquimica Metabolica. 1. Metabolismo de CarbohidratOs

Practica Ne 1 Determinacion de azucares reductores Practica N° 2: Fermentacion de la glucosa por levaduras (Sacharomyces cerevisiae) Practica N° 3: Fermentacion del vino.

2. Ciclo de Krebs

Practica N° 4: Determinacion de la actividad succinato deshidrogenasa. Practica N° 5: Respiracion aerobia Practica N° 6: Respiracion en celulas vegetates Practica N° 7: Respiracion celular bn plantas y animates

3 . Cadena Transportadora de Electrones

_____________ _____ Manual de bioquimica metabdlica j 2010

Practica N° 8: Estudio del bombeo de protones por levaduras; efecto de los inhibidores de la cadena de transpose de electrodes y de los desacoplantes.

5. Metabolismo de los Lipidos

Practica N° 9: Radicales libres (lipoperoxidacion).

Pr&ctica N°10: Conversidn de lipidos a carbohidratos.

6. Metabolismo de los Aminoacidos y Nucleotidos

Practica N°10: Determination de acido urico en suelo. Pr&ctica N°11: Transaminacion. VII. Preparation de Soluciones

Manual de bioqulmica metabolica 2010 INTRODUCCION

La Bioqulmica es ia Ciencia que estudia los constituyentes quimicos de los seres vivos, sus funciones y transformaciones, es decir, estudia las bases moleculares de la vida. Segun se ha avanzado en el conocimiento cientlfico, se ha reconocido que gran parte de las enfermedades son consecuencia de alteraciones moleculares y que se requieren solidos fundamentos bioqulmicos para entender su fisiopatologla, para llegar al diagnostico y para desarrollar una terapeutica adecuada. Todo ello ha contribuido a que la bioqulmica tenga un papel trascendental en el campo de la salud y por tanto resulte imperativo proporcionar ai alumno los conceptos teoricos adecuados en cuanto a las principals rutas metabolicas de degradation y bioslntesis de biomoleculas, los aspectos bioenergeticos, su regulacion e interrelation que existe entre ellas, as! como complementar mediante la realization de experimentos que le permitan desarrollar sus habilidades anallticas e integrar los conocimientos adquiridos en sus cursos teoricos. Para lograr este objetivo es recomendable que el estudiante haga una revision y ampliation de la parte introductoria que acompana cada experimento y que sea capaz de aprender a aprender, construir sus propios conocimientos y demostrar que la ensehanza estrategica es integrada y aplicada a cada situation.

OBJETIVO. Ser un material de apoyo para la experiencia educativa, que permita al alumno Conocer a profundidad las rutas del metabolismo celular, con especial hincapie en su regulacion y en las interdependencias metabolicas entre diferentes organos, en situaciones de salud y enfermedad.

JUSTIFICACION Las practicas de laboratorio en la ensehanza de la Bioqulmica, tienen un rol importante en el proceso de aprendizaje, a traves del Cual se busca motivar al estudiante en la investigation con el desarrollo de experimentos y lograr con 1

Manual de bioquimica metabolica I 2010 ello promover el desarrollo del analisis y razonamiento vinculando

teoria y

experimentacidn, siendo esto el motivo primordial que plantea la necesidad de realizar un manual de practicas que cumpla con dichos requerimientos, en virtud de que en la actualidad no se cuenta con ningun material de apoyo educativo que se apegue al programa de estudios de la experiencia.

Desde esta

perspectiva,

consideramos

la

necesidad

de aplicar esta

herramienta de trabajo, con el compromiso de que se explote, investigue y profundice los topicos considerados adecuados a la experiencia educativa.

2

Manual de bioqufmica metabolica I 2010

I. Normas Generales del Laboratorio

i

3

Manual de bioquimica metabolica I 2010 Normas Generates del Laboratorio

Se pretende que el alumno tome contacto con el laboratorio, para lo cual se le indicaran las normas generates de comportamiento en el mismo, las reglas de seguridad que hay que observar, as! como las normas generates para la realizacion de las practicas de Bioquimica II.

A) Normas generates de com portam iento:

1. El alumno tiene la obligation de leer y estudiar con anticipation las experiencias a realizar en el laboratorio. El fundamento teorico, si no lo conoce, debera buscarlo en los libros adecuados. 2. A la hora senalada para el comienzo de las practicas el alumno debera estar en el lugar correspondiente y en su puesto. Sera obligatorio usar una bata blanca. No disponer de la bata blanca implica no poder realizar la practica de ese dia. 3. Todo alumno debera llevar cuaderno de practicas y una libreta donde hacer las anotaciones que estime oportunas, asi como una calculadora. 4. Durante el horario de practicas no se podra salir del laboratorio sin pedir permiso al profesor. 5. Esta PROHIBIDO realizar pruebas diferentes a las indicadas en este cuaderno de practicas. El alumno se cenirb escrupulosamente al mismo. 6. Se valorara la actitud que cada persona adopte durante la realizacion de las practicas, aspecto este determinante de la nota final. B) Reglas de seguridad:

1. En el laboratorio esta PROHIBIDO comer, beber o fumar. 2. Se tomaran las precauciones necesarias al trabajar con acidos, bases o sustancias peligrosas para evitar accidentes. Si precede trabajar en campana de extraction, usar guantes y gafas de protection. 3. En caso de introduccibn de alguna sustancia o disolucion extrana en los ojos, estos se lavaran con abundante agua utilizando un frasco lavador. Posteriormente se aplicara un colirio neutro o suero salino fisiologico. Si 4

Manual de bioquimica metabolica I 2010 accidentalmente se ingiriera un acido o base fuertes se administrara abundante agua o leche y se acudira a un centre medico. Las quemaduras

por

sustancias

corrosivas

se

trataran

lavandolas

adecuadamente y aplicando una pomada a tal fin. En todos los casos es imprescindible el posterior examen en un centro medico. Ante cualquier duda, incidencia o eventualidad se consultary y avisara al profesor encargado del laboratorio. 4. Si fuera necesario calentar el contenido de un tubo de ensaye a la llama, se hara con el tubo algo inclinado, agitando suavemente y con la boca del tubo dirigida hacia un lugar en que no haya ninguna persona. 5. Los residuos liquidos se vertiran a las pilas del fregadero, previa diluciOn con abundante agua. 6. Si se produce algun accidente, avisar rapidamente al profesor. C) Normas generales para la realizacion de las practicas:

1. Antes de comenzar la practica debera revisar que dispone de todo el material y productos necesarios para la misma, y que se encuentra todo limpio y en orden. Se notificara al profesor cualquier anomalia. Al finalizar la practica entregara todo el material perfectamente limpio v ordenado. avisando al profesor de haber terminado antes de abandonar el laboratorio. 2. Las pipetas deben estar bien limpias y secas antes de ser utilizadas. Pipetear siempre con la propipeta o perilla adecuada. No pipetear entre varias personas. 3. Todos los frascos, botellas, etc., han de estar correctamente etiquetados y cerrados, evitando que se confundan los tapones. Los recipientes donde se almacenan sustancias y disoluciones se deben marcar adecuadamente utilizando rotuladores, lapices de cera o etiquetas. En cada caso se indicarS la sustancia de que se trata y su concentracion, asi como la fecha de preparacion. 4. Se deben de anotar en el cuaderno de practicas las disoluciones preparadas y su concentracidn, asi como el volumen preparado de cada una. 5

Manual de bioquimica metabolica 2010 5. Todos los frascos y botellas que contienen los reactivos preparados deberan situarse en el sitio indicado por el profesor o encargado del laboratorio. 6. Cada alumno (con independencia de que haya formado parte de un grupo

de

varias

personas)

debera

presentar

el

informe

correspondiente a cada practica el dia de su realization, al fmalizar la misma. 7. Algunas de las preguntas de los cuestionarios se pueden responder si se leen los metodos generates. 8. Ante cualquier duda preguntar al profesor de practicas.

NOTA: SE RECUERDA QUE PARA SUPERAR LA AS1GNATURA ES NECESARIO APROBAR LAS PRACTICAS.26

RESIDUOS BIOLOGICO-INFECCIOSOS (RPBI). Podemos definir como

residuos peligrosos biologico infecciosos (RPBI) a

aquellos residuos que contienen agentes infecciosos en concentration suficiente para causar un dano directo a la salud que puede ser de naturaleza viral, bacteriana o micotica, entendiendo que estos agentes se definen como cualquier organismo capaz de transmitir una enfermedad, dichos residuos provienen de actividades asistenciales o experimentales de salud ya sea en humanos o animates. Resulta de suma importancia en el laboratorio el manejo adecuado de los RPBI para logar dicho objetivo podemos seguir los siguientes pasos: 1. Identificacion de los residuos. 2. Envasado de los residuos. 3. Almacenamiento temporal. 4. Recoleccion y transporte externo. 5. Tratamiento 6. Disposition final. El laboratorio de bioquimica metabolica sera generador de RPBI en algunas practicas que se efectuaran, por lo que se

abarcaran los puntos de

identificacion y envasado de residuos se describe a continuation como se 6

Manual de bioquimica metabolica I 2010 deben cubrir estos procedimientos de manera adecuada para prevenir cualquier tipo de accidente o mat manejo de dichos residuos. Se debe identificar el desecho de forma inmediata una vez terminado el metodo de donde se genera de su correcta identification se derivara su correcto envasado, los identificaremos de acuerdo a su estado flsico ya sea liquido o solido. Ser£n considerados RPBI en el laboratorio de Bioquimica Metabolica los siguientes: •

Sangre y los componentes de esta, solo en su forma llquida, as! como sus derivados incluyendo las fracciones celulares o a celulares de la sangre resultante (hemoderivados). La cual sera inactivada antes de ser desechada mediante la adicion de hipoclorito de sodio a partes iguales con un periodo de tiempo de diez minutos.

•

Los residuos no anatomicos como

recipientes desechables que

contengan sangre llquida. Los materiales de curacion, empapados, saturados, o goteando sangre o fluidos corporales.

•

Los objetos punzocortantes que han estado en contacto con humanos o animates o sus muestras biologicas

lancetas, agujas de jeringas

desechables, agujas hipod6rmicas, bisturls. Los RPBI se deben separar y envasar de conformidad con sus caracterlsticas flsicas y biologicas observando lo establecido en la tabla No. 2

segun la

NORMA Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002 como a continuation se indica. Tabla No 2. TIPO DE

ESTADO FISICO

ENVASADO

COLOR

RESIDUOS Sangre

Llquidos

Recipientes

Rojo

hermeticos Cultivos y cepas de

Solidos

Bolsas de

Rojo

7

Manual de bioquimica metabolica 2010 agentes

polietileno

infecciosos Patologicos

Solidos

Bolsas de

Amarillo

polietileno Liquidos

Recipientes

Amarillo

hermeticos Residuos no

Solidos

anatomicos

Bolsas de

Rojo

polietileno Liquidos

Recipientes

Rojo

hermeticos Mo consideraremos como residuo peligroso biologico infeccioso los siguientes: •

Torundas y gasas con sangre seca o manchada de sangre.

•

Material de vidrio utilizado en el laboratorio.

Muestras de orina y excremento utilizados en el laboratorio

8

Manual de bioquimica metabdlica 2010

II. Practicas

9

Manual de bioquimica metabblica I 2010 1. Metabolismo de Carbohidratos Los carbohidratos pueden definirse como aldehidos y cetonas polihidroxilicos, y sus derivados; reciben este nombre por la observation de que la formula empirica de muchos integrantes de este grupo son: CnN2nOn , por lo tanto la mayor parte de los carbohidratos consta de estos tres elementos. (1)

Todos los organismos obtienen energia de la degradation oxidativa de glucosa y otros carbohidratos. Incluso para algunas celulas y organismos, como las celulas del cerebro y muchas bacterias, esta es la principal o unica fuente de energia. () El metabolismo de los carbohidratos complejos, empieza en la boca, cuando la saliva descompone los almidones. Despues en el estomago, mediante la action del acido clorhldrico, el metabolismo continua y termina en el intestino delgado. All! la amilasa (enzima del jugo pancreatico), trasforma al almidon en maltosa. La maltosa, pasa a ser trasformada en glucosa.

La glucosa pasa al torrente sangulneo, y es oxidada en las celulas proporcionandonos 4 kilocalorias por cada gramo. La glucosa que no es quemada se transforma en glucogeno, el cual se almacena en hlgado y en musculos. (2) Los niveles de glucosa tambien se pueden aumentar mediante slntesis (gluconeogenesis) partiendo del piruvato o lactato. Ademas de su funcion tan importante en el metabolismo energetico, la glucosa tambten es un precursor en la sintesis de polisacaridos estructurales como celulosa, disacaridos como sacarosa y lactosa y de otros monosacaridos como galactosa y fructosa. A continuation se exponen los detalles dela ruta glucolitica.3 ()

10

Manual de bioquimica metabolica 2010

La glucolisis es la via metabolica por la que se degrada la glucosa; filogeneticamente, es la via mas antigua y consiste en una secuencia de reacciones enzimaticas en las cuales se degrada la glucosa. La glucolisis puede dividirse en dos fases: una de activacion y una oxidativa. La fase de activacion consiste en la transferencia de fosfatos a la glucosa con gasto de dos ATP y en su ruptura en dos moleculas de gliceraldehido 3 fosfato; en la fase oxidativa, el gliceraldehido 3 fosfato es transformado en piruvato con la obtencion de cuatro moleculas de ATP por fosforilacion a nivel de sustrato. () Las reacciones de la glucolisis ocurren en el citoplasma y no estan ligadas a estructuras celulares. El producto de la via es el piruvato, el cual puede seguir diversos destinos segun las condiciones de la celula. Bibliografia: Milton Toporek, bioquimica, editorial interamerican, segunda edicion, pag. 7 http://modelode.com/modelos/ld-metabolismo-de-los-carbohidratos.php

11

Manual de bioqulmica metabolica I 2010 PRACTICA No. 1 Determinacion de azucares reductores

OBJETIVO: Observar de forma cualitativa la existencia de los grupos aldehldos y cetonas. Visualizar la demostracion colorimetrica, que se basa en la variacion de color de diferentes sustancias qulmicas por el poder reductor del grupo carbonilo.

FUNDAMENTO: Una caracteristica fundamental de los aldehldos y de las cetonas, es la existencia en su estructura del grupo funcional carbonilo (C = O). Cuando el carbonilo esta asociado a un carbono primario forma los aldehldos, y cuando est£ en un carbono secundario da lugar a las cetonas. Los glucidos monosacaridos (azucares) segun tengan el grupo funcional aldehldo o cetona, se dividen en aldosas o cetosas. Los aldehldos y las cetonas de 6 o mas carbonos forman estructuras clclicas del tipo furanosa (5 vertices) o piranosa (6 vertices). La estructura abierta (no clclica) de estas moleculas se caracteriza por que el carbono del grupo carbonilo no es asimetrico (2 valencias ocupadas por el oxlgeno), pero cuando se forman los ciclos, (estructura de Haworth) el carbono que forma parte del grupo carbonilo se hace asimetrico (unido a cuatro grupos distintos), aumentando el numero de isomeros opticos.

Las estructuras abiertas y cerradas son convertibles entre si y existe un equilibrio entre ambas formas. Para que un azucar sea reductor debe tener el grupo carbonilo libre, por lo que el carScter reductor esta presente en los monosacaridos. En el caso de los disacaridos, poseen car£cter reductor aquellas moleculas cuyo OH del carbono anomerico de la segunda molecula no interviene en la reaccion acetal, como es el caso de la maltosa (glucosa + glucosa, enlace 1-4), mientras que la sacarosa (glucosa + fructosa, enlace 1-2), pierde esta funcion por desaparecer el OH del carbono anomerico de la fructosa. 12

Manual de bioquimica metabblica I 2010

Los monosacaridos mas comunes son la glucosa, la fmctosa, la galactosa y la manosa. Un carbohidrato que puede ser hidrolizado en dos moldculas de monosacaridos es llamado disacarido. Los mds importantes son la lactosa (presente en la leche), la sacarosa (presente en el azucar comun) y la maltosa. Por su parte, aquellos carbohidratos que pueden ser hidrolizados en varias moleculas de monosacaridos son llamados polisacaridos. Los mas comunes son el almidon y la celulosa, este ultimo es componente estructural de las plantas.

6c h 2oh HOCHo

H

|3

H

[2

j\

OH HO

OH

H

Fructosa

Glucosa

Unidad de glucosa Unidad de galactosa

H

dH

CH2-0H

LACTOSA

13

Manual de bioquimica metabolica I 2010 Unidad de glucosa

Unidad de glucosa

Unidad de glucosa

Unidad de fructose

PRUEBA DE BENEDICT Algunos azucares tienen la propiedad de oxidarse en presencia de agentes oxidantes suaves como el ion Fe3+ o Cu2+. Esta caracteristica radica en la presencia de un grupo carbonilo libre, el cual es oxidado y genera un grupo carboxilo. Por lo tanto, aquellos azucares con un grupo carbonilo libre son llamados azucares reductores y aquellos en los que el grupo carbonilo se encuentra combinado en union glicosidica se conocen como azucares no reductores. Existen varias reacciones quimicas que permiten determinar si se esta en presencia de un azucar reductor o no. La prueba de Benedict es una de ellas y se basa precisamente en la reaction o no de un azucar con el ion Cu2+ El reactivo de Benedict contiene soluciones de carbonato de sodio, sulfato de cobre, y citrato de sodio. El Na2CQ3 confiere a la solucion un pH alcalino necesario para que la reaccidn pueda llevarse a cabo. El citrato de sodio mantiene al ion Cu2+ en solucion ya tiene la propiedad cje formar complejos

14

Manual de bioquimica metabolica j 2010 coloreados poco ionizados con algunos de los metales pesados. Con el cobre produce un complejo de color azul. Si se le agrega al reactivo una solucion de azucar reductor y se calienta hasta llevar la mezcla a ebullicion, el azucar en solucion alcalina a elevadas temperaturas se convertira en D-gluconato y su ene-diol, rompibndose luego en dos fragmentos altamente reductores, los cuales con sus electrones expuestos, reaccionaran con el Cu++. Se obtiene entonces un azucar oxidado y dos iones Cu+. Posteriormente el Cu+ producido reacciona con los iones OH" presentes en la solucibn para formar el hidroxido de cobre. La aparicion de un precipitado amarillo, anaranjado, o rojo ladrillo evidencia la presencia de un azucar reductor. MATERIALES Y REACTIVOS -Reactivo de Benedict: consta de 3 soluciones: Pesar 100 g de Na2C03 anhidro y disolver en 200 ml de agua destilada hervida. Pesar 173 g citrato de sodio y disolverlo en 200 ml de agua destilada hervida. Pesar 17.3 g de CuS04.5H20 y disolverlo en 300 ml de agua destilada hervida. Mezclar las tres soluciones cuando esten frias. Aforar a 1 L con agua destilada hervida. -Soluciones de carbohidratos al 2% Glucosa Fructosa Galactosa Sacarosa Maltosa Lactosa -1 gradilla o vaso de precipitado -6 tubos de ensayo de 15 x 150 -6 pipetas de 5 ml. y 6 de 2 ml. -1 Tripie 15

_____________________________ Manual de bioquimica metabolica | 2010 -1 Tela de asbesto -1 mechero -1 vaso de precipitado de 500 ml -Pinzas para tubo -Perilla

PROCEDIMIENTO:

1. Depositar a cada tubo 2.5 ml del reactivo de Benedict 2. Adicionar a cada tubo 1 ml de un carbohidrato diferente procurando marcar el tubo para identificarlo. 3. Observar el color que adopta. 4. Colocar los tubo en bano de agua hirviendo durante 5 minutos (uno por uno) 5. Observar cualquier cambio de color durante el calentamiento (rojo, anaranjado o verdoso) 6. Sacar el tubo y ponerlo en la gradilla y despubs de un corto tiempo observar si se ha formado algun precipitado. 7. Anotar los resultados para cada tubo RESULTADOS: -Elaborar un cuadro con los carbohidratos que utilizo, si se form6 un precipitado y de que color es el mismo.

PREGUNTAS: -^Concuerdan sus resultados con lo esperado tebricamente sobre carbohidratos reductores? Explique. -^Que otro reactivo se puede utilizar para el analisis de azucares reductores?

- 2 ADP + 2 piruvato + 4 ATP + 2 NADH

Manual de bioquimica metabolica I 2010 REACTIVOS: . Solucion de glucosa al 1% . Reactivo de benedict. . Levadura de panadero seca activa.

PROCEDIMIENTO: 1. - En un vaso de precipitado de 25 ml. Pipetear 10 ml de la solucibn de glucosa y anadir 0.3 g (la punta de una espatula) de levadura. Mezcle perfectamente hasta que la mezcla sea homogenea. Incubar a 37 grados centfgrados. Realizar una prueba de Benedict a esa mezcla a los 30 min., y a la hora y media de incubation.

2. - Para verificar que la solucion de glucosa es un azucar reductor, realizar una prueba de Benedict a la solucibn de glucosa.

3. - Para verificar que la levadura no contiene la presencia de ningun azucar reductor realizar un bianco de la siguiente manera: Mezcle 0.3 g (la punta de una espbtula) de levadura con 10 ml. de agua destilada. Efectue una prueba de Benedict tomando 0.5 ml de esta solucibn de levadura.

INTERPRETACION: 1. Muestra no fermentada: reaccion de Benedict positiva (rojo ladrillo)

2. Muestra fermentada: reaccion de Benedict negativa (azul). RESULTADOS Y OBSERVACIONES:

CONCLUSIONES:

Manual de bioquimica metabolica I 2010

PREGUNTAS: 1.-