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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k kInt. Cl. : A61K 7/48

11 N´ umero de publicaci´on:

2 176 808

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˜ ESPANA

A61K 7/06 A61K 35/78

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 97951332.2 kFecha de presentaci´on: 15.12.1997 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 948 313 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 13.10.1999

T3

86 86 87 87

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54 T´ıtulo: Nuevas utilizaciones de un extracto de resina de okume, en los campos cosm´ etico y far-

mac´ eutico, especialmente el dermatol´ ogico.

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73 Titular/es: PARFUMS CHRISTIAN DIOR

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72 Inventor/es: Renimel, Isabelle y

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74 Agente: Ungr´ıa L´ opez, Javier

30 Prioridad: 16.12.1996 FR 96 15448

33, Avenue Hoche 75008 Paris, FR

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

01.12.2002

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

ES 2 176 808 T3

01.12.2002

Aviso:

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Andre, Patrice

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art. 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 176 808 T3 DESCRIPCION Nuevas utilizaciones de un extracto de resina de okume, en los campos cosm´etico y farmac´eutico, especialmente el dermatol´ogico. 5

La invenci´on se refiere a nuevas utilizaciones de un extracto de resina de okume, en los campos cosm´etico y farmac´eutico, especialmente el dermatol´ogico.

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Se refiere m´as precisamente a las utilizaciones como agente cosm´etico de un extracto de resina de okume, m´ as particularmente para el cuidado de la piel, las u˜ nas y del cabello. Tambi´en se refiere a ciertas utilizaciones en el campo de la farmacia.

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El okume es el nombre vern´ aculo correspondiente a la planta Aucoumea klaineana que es la ´unica especie del g´enero Aucoumea de la familia de las Burseraceae. ´ El okume es un gran a´rbol de los bosques ecuatoriales h´ umedos de Africa Occidental y Central. Se utiliza para madera y proporciona la mayor parte de la madera exportada por Gab´ on.

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Las ramas j´ovenes est´an cubiertas de una pelusa ferruginosa. Las hojas alternas, pinadas impares, con fol´ıolos ovales alargados, son lisas y brillantes. Las hojas j´ovenes son de color rojo vivo; aparecen a partir del mes de octubre, hasta diciembre-enero, dando a la cima un tinte rojizo, que permite reconocer desde el avi´ on las poblaciones de okumes.

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Las inflorescencias son en pan´ıculas de 10 a 20 cms de longitud, con flores blanquecinas, casi inodoras. La floraci´ on tiene lugar en octubre-noviembre. Los frutos en forma de c´ apsula son lisos, se abren en 5 l´obulos cori´aceos. Los granos son triangulares, prolongados por un ala en forma de l´ amina. Los frutos aparecen hacia el mes de febrero.

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El color de la corteza var´ıa entre el rojo heces de vino y el rosa salm´on en funci´ on de la edad de la planta. Esta corteza es ligeramente fibrosa, casi granulosa y, mediante incisi´ on deja exudar una resina, u ´oleo-resina, con un fuerte olor a trementina, que se vuelve opaca y al coagularse. 35

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Esta resina contiene esencialmente monoterpenos y triterpenos con esqueleto oleanano y tirucalano. Se conocen utilizaciones tradicionales de esta resina: al principio la resina de okume se utilizaba en Gab´ on para fabricar antorchas utilizadas en las ceremonias de iniciaci´ on. Esta utilizaci´on, que a´ un persiste en nuestros d´ıas en los pueblos, se extiende a las ciudades con ocasi´on de celebraciones familiares. En las misiones, se emplea como suced´aneo del incienso. En la medicina ind´ıgena, se utiliza para hacer madurar los abscesos y en el tratamiento de las heridas en las que activar´ıa la cicatrizaci´on. En el plano farmacol´ ogico, la o´leo-resina presenta un poder antibacteriano debido, en particular, a los fenoles contenidos en el aceite esencial.

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Para m´ as detalles sobre las utilizaciones y las propiedades del okume o de su o´leo-resina, se puede remitir a las publicaciones siguientes: - A.M.Tessier, P. Delaveau, N. Piffault, J. Hoffelt. Planta med. 46, 41(1982), 50

- P. Delaveau, P. Lallouette, A.M. Tessier, Planta Med., 40, 49 (1980), - P. Delaveau, A.M. Vidal-Tessier. Bull. Soc. Bot. Fr., 135, Actualit´es bot., 3, 25 (1988).

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Los ensayos sistem´aticos realizados por los inventores han permitido poner en evidencia un cierto n´ umero de acciones enzim´aticas sorprendentes de esta resina, en particular acciones de inhibici´ on de varias enzimas, en particular la queratinasa, la elastasa, la fosfolipasa A2 y la lipoxigenasa, lo que ha permitido considerar su utilizaci´ on en los productos cosm´eticos, especialmente en productos destinados al cuidado de la piel, de las u˜ nas y del cabello. ´ La queratinasa es una enzima producida en el cuerpo esencialmente por los hongos. Esta se produce industrialmente a partir de Streptomyces fradiae. Su acci´ on sobre la piel y los f´ aneros conducen a una degradaci´on de las queratinas, lo que ocasiona especialmente una desorganizaci´on de la estructura de los 2

ES 2 176 808 T3 f´ aneros (u˜ nas blancas y estriadas, cabellos quebradizos, etc.).

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La elastasa, enzima de degradaci´on de la elastina, est´ a presente en las c´elulas, especialmente en las c´elulas d´ermicas (fibroblastos) as´ı como, en menor medida, en las c´elulas de la epidermis (queratinocitos). Se ha observado que la cantidad y la actividad de la elastasa aumentan en el curso del proceso de envejecimiento cut´aneo, tanto intr´ınseco como act´ınico. Por una degradaci´ on de las fibras de la elastina, la acci´on de la elastasa tiene como consecuencia una p´erdida de elasticidad cut´anea, una relajaci´ on de la piel y la aparici´ on de arrugas. ´ preLa fosfolipasa A2 (PLA2 ) es una enzima producida por las c´elulas al nivel de la membrana. Esta domina en c´elulas relacionadas con los fen´ omenos de inflamaci´ on, tales como los mastocitos. Mediante su acci´on, ´esta libera el ´acido araquid´ onico ligado a los fosfol´ıpidos de la membrana. Este a´cido se metaboliza despu´es en diferentes mediadores lip´ıdicos de la inflamaci´ on y de la alergia, tales como los leucotrienos y las prostaglandinas.

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La 5’-lipoxigenasa, en adelante designada como “lipoxigenasa”, es, como la PLA2, una enzima de la ´ membrana. Esta interviene en la “cascada de la inflamaci´on ” despu´es de la liberaci´on del a´cido araon. quid´ onico por la PLA2 , en la conversi´on de este ´acido en leucotrienos, mediadores de la inflamaci´ 20

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De esta forma, los inventores han demostrado que, gracias a su acci´on inhibidora sobre las enzimas antes mencionadas, los extractos de resina de okume presentaban un gran inter´es en cosm´etica y en terap´eutica. M´ as particularmente, la invenci´on aporta composiciones destinadas al cuidado de las u˜ nas, del cabello y de las pesta˜ nas, a la lucha contra los efectos del envejecimiento de la piel, a la prevenci´ on o al tratamiento de las inflamaciones y de las alergias cut´ aneas. En efecto, debido al descubrimiento de la actividad de los extractos de resina de okume que inhiben la acci´on de las enzimas, la invenci´on aporta diferentes soluciones en el campo de la cosm´etica y de la terap´eutica, especialmente de la dermatolog´ıa. En el caso de la inhibici´ on de la queratinasa, las composiciones seg´ un la invenci´ on permiten prevenir y tratar el deterioro de las estructuras querat´ınicas, especialmente las de los f´aneros, en particular de las u˜ nas, del cabello y de las pesta˜ nas. En el caso de la inhibici´ on de la elastasa, las composiciones seg´ un la invenci´ on se oponen a la degradaci´ on de las fibras de elastina y, por ello, estas composiciones mantienen las calidades biomec´anicas de la piel, en particular sus cualidades de elasticidad al nivel de la dermis, y permiten luchar contra la relajaci´on de la piel y la aparici´ on de arrugas. En el caso de la inhibici´ on de fosfolipasa A2 por una parte y de la lipoxigenasa por otra, las composiciones seg´ un la invenci´ on act´ uan as´ı doblemente en el proceso de formaci´ on de mediadores de la alergia cut´ anea y de la inflamaci´ on, limitando o bloqueando este proceso. Seg´ un otra ventaja de la invenci´ on, la resina de okume se vuelve soluble en numerosos disolventes org´ anicos. Incluso es soluble casi en su totalidad en los ´esteres como el acetato de etilo y el acetato de butilo, lo que hace que su inter´es sea a´ un mayor para la fabricaci´ on de esmaltes de u˜ nas, que utilizan estos disolventes muy generalmente, en particular para la fabricaci´on de esmaltes para tratamiento de las u˜ nas.

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Otra ventaja de la utilizaci´ on de extractos de resina de okume en los productos de tratamiento de las u˜ nas, especialmente en los esmaltes de u˜ nas, consiste en que estos extractos poseen en s´ı mismos un car´acter film´ogeno cuando se aplican sobre una superficie, especialmente la de la u˜ na. 50

Por otra parte, las calidades film´ ogenas de la resina de okume pueden aprovecharse tambi´en en composiciones destinadas a su aplicaci´on sobre el cabello o las pesta˜ nas, en particular en las composiciones destinadas al peinado tales como lacas, geles o emulsiones para el cabello, o incluso en las composiciones de mascarillas para mejorar el volumen de las pesta˜ nas.

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Otras ventajas de la invenci´ on se reducen a la vista de la descripci´on y de los ejemplos siguientes. As´ı, seg´ un una de sus caracter´ısticas esenciales, la invenci´ on se refiere a composiciones cosm´eticas que contienen un extracto de resina de okume en presencia de un veh´ıculo cosm´eticamente aceptable.

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El extracto se obtiene ventajosamente por maceraci´ on de la resina en un disolvente de polaridad media o d´ebil, seguida de una filtraci´ on de la mezcla. Si es necesario se puede evaporar el disolvente de la soluci´on obtenida para obtener el extracto seco. 3

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Por disolvente de polaridad media o d´ebil, se entiende un disolvente que presente un par´ ametro de polaridad inferior o igual a 6, estando definido tal ´ındice en Practical High Performance Liquid Chromatography, V.R. Meyer, 1988, p. 120-121. 5

Preferentemente, la evaporaci´on se realizar´a a presi´on reducida. Como disolventes utilizados ventajosamente, cabe citar: 10

- los hidrocarburos alif´ aticos en C6 a C12 , tales como el hexano y el heptano, - los disolventes clorados, especialmente el diclorometano,

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- los ´eteres, tales como el ´eter et´ılico o diisoprop´ılico, - la acetona, - los ´esteres tales como el acetato de etilo y el acetato de butilo,

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- los alcoholes en C1 a C4 , tales como el metanol, el etanol y el isopropanol. Tambi´en se podr´ a obtener el extracto de resina de okume por la t´ecnica mencionada de la extracci´on al di´ oxido de carbono supercr´ıtico.

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El rendimiento de la extracci´on depende esencialmente de la edad del ´arbol. As´ı, utilizando como disolvente el acetato de etilo, se obtendr´a un rendimiento de extracci´ on comprendido entre el 90 y el 98 % seg´ un la edad del a´rbol.

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Seg´ un un modo de realizaci´ on ventajoso, esta composici´on comprende del 0,01 al 10 % en peso y en particular del 0,2 al 1 % en peso de extracto seco de resina de okume, en relaci´ on con el peso total de la composici´ on final. Seg´ un otros modos ventajosos de realizaci´ on de la invenci´ on, la composici´on se formula para una aplicaci´on t´ opica sobre la piel, sobre el cabello, las pesta˜ nas o sobre las u˜ nas. Por otra parte, los ensayos realizados por los inventores han demostrado claramente que, no s´ olo el rendimiento de extracci´ on estaba relacionado con la naturaleza del disolvente utilizado, sino tambi´en la actividad enzim´atica del extracto. Los ejemplos adjuntos en el anexo demuestran claramente el efecto de la elecci´on del disolvente sobre la actividad enzim´atica del extracto. La cantidad de extracto se elegir´a igualmente en funci´ on del efecto film´ ogeno deseado. En efecto, seg´ un una ventaja particular relacionada con la naturaleza del producto, el extracto permite conferir a la composici´on cualidades film´ogenas o mejorarlas.

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Las composiciones seg´ un la invenci´ on pueden formularse seg´ un cualquier forma aceptable para su empleo en cosm´etica. Particularmente, puede tratarse de una crema, especialmente de una crema para la cara o las manos, de un gel, especialmente de un gel para el cabello, de un b´ alsamo, especialmente de un b´ alsamo desenredante, de una mascarilla, de una base de maquillaje o de una preparaci´ on para las u˜ nas, tales como una base tratante o un esmalte para tratar las u˜ nas. Seg´ un otro aspecto, la invenci´ on se refiere a la utilizaci´on de la resina de okume como agente cosm´etico, incorpor´ andose este agente en una composici´on cosm´etica tal y como se define anteriormente.

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La cantidad de este agente podr´ a adaptarse en funci´ on particularmente de las calidades film´ogenas investigadas para la composici´on. Las composiciones cosm´eticas de la invenci´on se utilizar´ an en cualquier campo relacionado con el cuidado o el maquillaje.

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Este agente cosm´etico se utilizar´a especialmente en todas las aplicaciones donde se pretenda, en particular, inhibir la acci´ on de la queratinasa y/o de la elastasa y/o de la fosfolipasa A2 y/o de la lipoxigenasa.

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ES 2 176 808 T3 Estas composiciones se destinar´an, en particular, al cuidado de las u˜ nas, del cabello o de las pesta˜ nas, en particular para mantenerlos en buen estado en cuanto a su estructura querat´ınica, para facilitar el peinado o para mejorar el maquillaje de las pesta˜ nas. 5

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Tambi´en se utilizar´an para luchar contra los efectos del envejecimiento de la piel, especialmente preservando o mejorando las calidades biomec´ anicas de la piel, en particular su elasticidad, retrasando la aparici´ on de arrugas o disminuyendo su profundidad y mejorando la firmeza cut´ anea. ´ Estas se utilizar´an tambi´en para luchar contra los efectos nocivos de los radicales libres sobre la piel, para el cuidado o el maquillaje de las pieles sensibles, especialmente atenuando o suprimiendo los fen´ omenos de irritaci´on, de inflamaciones o de alergias que se traducen en general a nivel cut´aneo en rojeces, sensaciones de quemadura y picaz´ on. As´ı, las composiciones cosm´eticas de la invenci´on se utilizar´an especialmente para cualquier aplicaci´on cosm´etica con la que se persiga inhibir la actividad de las enzimas antes mencionadas. Este es el caso, en particular, de las composiciones destinadas al cuidado del cabello, de las pesta˜ nas o de las u˜ nas, donde se persigue especialmente esta actividad anti-queratinasa.

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Adem´as, seg´ un otro aspecto, la invenci´ on se refiere a las composiciones cosm´eticas destinadas al cuidado de la piel, en particular para luchar contra el envejecimiento cut´ aneo o la inflamaci´ on. Seg´ un otro aspecto m´ as de la invenci´on esto se refiere a composiciones cosm´eticas destinadas al cuidado del cabello. Puede tratarse en particular de lacas, de geles o de emulsiones para el cabello.

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La invenci´on se refiere igualmente a los productos de maquillaje, en particular de maquillaje tratante, tales como los esmaltes de u˜ nas, las mascarillas o las bases de maquillaje.

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Seg´ un un aspecto especialmente interesante de la invenci´ on, ´esta se refiere igualmente a las composiciones cosm´eticas destinadas al tratamiento de las u˜ nas. En efecto, la queratina, prote´ına de estructura, es predominante en la u˜ na y le confiere su rigidez. Al ir envejeciendo, las queratinas se vuelven menos r´ıgidas, lo que se traduce en u˜ nas m´ as flexibles, m´as fr´ agiles y tambi´en m´as vulnerables al ataque de ciertas proteasas como la queratinasa. Por tanto, las composiciones de la invenci´on pueden utilizarse ventajosamente para el cuidado de las u˜ nas, debido particularmente a su acci´ on de inhibici´ on de la queratinasa demostrado por los ensayos realizados por los inventores.

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Adem´as de las propiedades de inhibici´ on de la queratinasa y su solubilidad casi total en los disolventes utilizados en la preparaci´ on de los esmaltes de u˜ nas, la resina de okume presenta la ventaja de mejorar el car´acter film´ogeno de estas composiciones, contribuyendo as´ı en gran medida a las propiedades reol´ ogicas y a las calidades de estos esmaltes tras su aplicaci´on sobre las u˜ nas.

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Como ya se ha visto anteriormente, la eficacia de las composiciones cosm´eticas antes descritas puede estar correlacionada con un cierto n´ umero de actividades enzim´aticas. La demostraci´ on de estas actividades enzim´aticas ha permitido considerar tambi´en la utilizaci´on de los extractos antes definidos para la preparaci´ on de composiciones farmac´euticas, especialmente dermatol´ogicas en las que se desean dichas actividades. Los ensayos realizados por los inventores de la presente invenci´ on han confirmado la eficacia de estas composiciones farmac´euticas. on de la 5’-lipoxigenasa pueden estar correlacionadas As´ı, la inhibici´ on de la fosfolipasa A2 y la inhibici´ con una eficacia en la prevenci´on y el tratamiento de los fen´ omenos de inflamaci´on. Por otra parte, la actividad de inhibici´ on de la queratinasa puede estar tambi´en relacionada con una actividad en el campo del tratamiento de trastornos que afectan a la queratina, especialmente a nivel de las u˜ nas, de las pesta˜ nas y del cabello.

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As´ı, seg´ un otra caracter´ıstica esencial, la invenci´on se refiere tambi´en a la utilizaci´on de un extracto de resina de okume para la preparaci´ on de una composici´ on farmac´eutica, especialmente dermatol´ogica, destinada a la prevenci´ on o al tratamiento de afecciones de f´ aneros, en particular de las u˜ nas, traduci´endose en una degradaci´ on de las estructuras querat´ınicas, tales como la onicomicosis, en el tratamiento de los efectos nocivos de los radicales libres sobre la piel, en la prevenci´on o en el tratamiento de las manifestaciones cut´ aneas de las alergias y las inflamaciones, incorpor´andose dicho extracto a un veh´ıculo farmac´euticamente aceptable. 5

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La invenci´on se refiere tambi´en a los procesos de tratamiento terap´eutico, especialmente dermatol´ogico, destinados a la prevenci´ on o al tratamiento de las afecciones de los f´ aneros, en particular de las u˜ nas, traduci´endose en una degradaci´ on de las estructuras querat´ınicas, tales como la onicomicosis, al tratamiento de los efectos del envejecimiento intr´ınseco o act´ınico de la piel, al tratamiento de los efectos nocivos de los radicales libres sobre la piel, a la prevenci´on o al tratamiento de las manifestaciones cut´ aneas de las alergias y de las inflamaciones, seg´ un los cuales se aplica sobre la parte del cuerpo a tratar una cantidad eficaz de una composici´on farmac´eutica que contenga un extracto de resina de okume.

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Para estas diferentes aplicaciones, la composici´on farmac´eutica presenta ventajosamente una actividad inhibidora de la queratinasa y/o de la elastasa y/o de la fosfolipasa A2 y/o de la lipoxigenasa.

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Seg´ un una variante, la invenci´ on se refiere a la utilizaci´on de un extracto de resina de okume para la preparaci´ on de una composici´ on farmac´eutica, especialmente dermatol´ogica destinada al tratamiento y a la prevenci´on de las manifestaciones al´ergicas, particularmente de la alergia cut´ anea o al tratamiento de los efectos nocivos de los radicales libres. Estos dos tipos de aplicaci´ on est´an directamente relacionados con la inhibici´ on de los mediadores lip´ıdicos de la inflamaci´ on.

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En estas aplicaciones del campo farmac´eutico, especialmente dermatol´ogico, las composiciones utilizadas son preferentemente composiciones para aplicaci´on t´ opica destinadas para su aplicaci´ on en particular sobre la piel y los f´ aneros. Por otra parte, los extractos de resina de okume utilizados para su preparaci´on se obtienen de la misma forma que los extractos utilizados en el campo cosm´etico y se introducen en un veh´ıculo farmac´euticamente, en especial dermatol´ogicamente, aceptable en concentraciones comprendidas entre el 0,01 % y el 10 % en peso y en particular entre el 0,2 % y el 1 % en peso, de extracto seco de dicha resina. Como en el caso de las aplicaciones cosm´eticas, se elegir´a el disolvente de extracci´on en funci´ on del tipo de actividad enzim´ atica que se desee privilegiar en la acci´on de la composici´on farmac´eutica. Las composiciones farmac´euticas, especialmente dermatol´ogicas, de la invenci´ on podr´ an, adem´ as, contener diferentes sustancias activas farmacol´ogicamente utilizables en el tratamiento de las patolog´ıas de los f´ aneros, en particular de las u˜ nas.

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´ Estas podr´ an, en particular, contener agentes conocidos por su actividad anti-f´ ungica, especialmente agentes activos sobre los dermatofitos responsables, en particular, de la onicomicosis. Entre estos agentes, se pueden citar la sal de etanolamina del ciclopirox, tambi´en denominado ciclopirox olamina. Los ejemplos siguientes se dan a t´ıtulo puramente ilustrativo de la invenci´ on. Con referencia a estos ejemplos, se dan tambi´en las figuras 1 a 4 que representan respectivamente:

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- figura 1: la evoluci´ on de la absorbancia a 280 nm en funci´ on del tiempo en presencia de un medio reactivo que contenga queratinasa, fragmentos de u˜ nas y tanto en presencia (curva 1) como en ausencia (curva 2) de resina de okume. Esta figura se presenta como referencia para el ejemplo 3; - figura 2: una fotograf´ıa en microscopio electr´onico de 350 aumentos de una u˜ na no tratada;

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- figura 3: una fotograf´ıa en microscopio electr´onico de 350 aumentos de una u˜ na despu´es del tratamiento con queratinasa durante 48 h; - figura 4: una fotograf´ıa en microscopio electr´onico de 350 aumentos de una u˜ na despu´es del mismo tratamiento que en el caso de la figura 3, pero tambi´en en presencia de extracto de resina okume.

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- Salvo indicaci´ on en contrario, las proporciones dadas en los ejemplos de composiciones se expresan como porcentaje en peso.

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ES 2 176 808 T3 Ejemplo 1 Preparaci´ on de un extracto de ´ oleo-resina de okume seg´ un la invenci´ on 5

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100 g de o´leo-resina previamente triturada se introducen en 1000 ml de acetato de etilo. La suspensi´ on se deja a temperatura ambiente en agitaci´ on moderada durante 3 horas. Despu´es se filtra la mezcla, se evapora el disolvente del filtrado as´ı obtenido a presi´ on reducida. Se recuperan entonces aproximadamente 95 g de extracto seco de resina de okume que presenta el aspecto de residuo de sirope. Para preparar las composiciones seg´ un la invenci´ on, se puede utilizar la soluci´on del extracto de resina, eventualmente concentrada, en el disolvente de extracci´on o bien el extracto seco. As´ı, para la preparaci´ on de esmalte de u˜ nas seg´ un la invenci´ on, se podr´ a utilizar directamente una soluci´on de la resina en acetato de etilo o de butilo. Por ejemplo, se podr´ a utilizar una soluci´ on al 10 % en extracto de resina. Ejemplo 2

15

Demostraci´ on de la actividad inhibidora de la o ´leo-resina de okume sobre las diferentes enzimas 2.1 Extractos utilizados 20

25

Una vez realizados los ensayos de inhibici´on enzim´aticos en medio acuoso, es necesario utilizar disolventes de extracci´on mezclables con el agua. De esta forma, procediendo como se describe en el ejemplo 1 pero con otros disolventes, se han preparado tres extractos diferentes con agua, metanol y DMSO respectivamente. La concentraci´ on de estos extractos se ajusta despu´es en 0,5 % en extracto seco de resina, bien por adici´on o por evaporaci´ on del disolvente de extracci´on. Todos los ensayos descritos a continuaci´on se han realizado tres veces. Los valores obtenidos son las medias aritm´eticas.

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2.2 Inhibici´ on de la elastasa a) Principio del ensayo 35

Diferentes autores han descrito las t´ecnicas de demostraci´ on de la inhibici´ on de la elastasa (BAUMSTARK, J.S. et al., Biochim. Biophys. Acta (1963), 77, 676; BYETH, B. et al. Biochem. Med., (1974), 11, 350; C. FRANCK, I. BYRJALSEN, Biol. Chem. Hoppe Seyler, (1988) 369 (8) 677-82)

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El principio activo es el siguiente: se pone un sustrato en presencia de elastasa en medio acuoso, despu´es, tras incubaci´ on, se efect´ ua una medici´ on de los productos de la reacci´on.

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En este caso, el sustrato es el N-succinil-(ala)3-para-nitroanilida, que se puede adquirir de la Sociedad Sigma (Ref.: S 4760) en soluci´on de 0,5 mg/ml en un tamp´on tris-HCl 0,2 M a pH 8,8. La elastasa a˜ nadida al medio reactivo libera la para-nitroanilina y el residuo pept´ıdico. La evoluci´ on de la reacci´ on R (Kontron S.A.) con una longitud de onda λ de 379 nm. se observa en el espectrofot´ometro Uvikon 941 La composici´on del medio reactivo es la siguiente:

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- soluci´on de sustrato (0,5 mg/ml de tamp´ on) - tamp´ on tris-HCI - disolvente de extracci´on

: 200 µl : 600 µl : 100 µl

El disolvente de extracci´on puede contener o no el efector, es decir, el extracto de resina de okume, a la concentraci´on del 0,5 % en peso, dependiendo de si se trata del ensayo con el efector o del ensayo sin el efector (actividad basal de la enzima). A estos 900 µl de medio reactivo se a˜ naden 100 µl de la soluci´ on de enzima a raz´on de 35 U/ml en el tamp´ on tris-HCI.

60

Se mide entonces la cin´etica de la liberaci´on de para-nitroanilina por la absorci´ on de una luz monocrom´atica con una longitud de onda de 379 nm por medio del espectrofot´ ometro, lo que permite calcular el porcentaje de inhibici´ on IE seg´ un la f´ ormula siguiente: 7

ES 2 176 808 T3

IE=

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∆AbB / mn - ∆AbE / mn x 100 ∆AbB / mn

en la que ∆AbB / mn es la diferencia de absorbancia por minuto del medio reactivo para la actividad basal, y ∆AbE / mn es la diferencia de absorbancia del medio reactivo para el ensayo con el efector. Los resultados figuran en el cuadro I a continuaci´ on. 2.3 Inhibici´ on de la fosfolipasa A2

10

Seg´ un el principio del ensayo (UTHE, J.F. and MAGEE, W.L., Can. J. Biochem. (1971), 49, 776; DENNIS, E.A., J.A., J. Lipids Res., (1973), 14, 152), la enzima aparece en presencia de un fosfol´ıpido. Este se transforma entonces en lisolecitina con liberaci´on de un a´cido graso, insoluble en el medio reactivo. Esta reacci´on puede ir seguida por tanto de turbidimetr´ıa por medio de un espectrofot´ ometro, utilizando por ejemplo la longitud de onda de 360 nm.

15

La composici´on del medio reactivo se indica a continuaci´on. Todas las soluciones se realizan en agua destilada. 20

25

30

-

soluci´on en 14 mM de L-fosfatidilcolina dimiristoilo (substrato) soluci´on de cloruro de sodio 0,67 M soluci´on de cloruro c´ alcico 66 mM agua destilada disolvente, con o sin efector al 0,5 %

: : : : :

600 150 200 850 100

µl µl µl µl µl

En este medio se a˜ naden 100 µl de soluci´on de enzima al agua destilada para la concentraci´ on de 96 U/ml. Como en el caso de la inhibici´on de la elastasa, la cin´etica reactiva se sigue por medio de un especR , para una longitud de onda de 360 nm. trofot´ ometro Uvikon 941 Se determina el porcentaje de la inhibici´ on IP de la fosfolipasa A2 mediante c´alculo siguiendo una f´ ormula an´ aloga a la de la inhibici´on de la elastasa

35

Ip=

∆AbB / mn - ∆AbE / mn x 100 ∆AbB / mn

en la que ∆AbB y ∆AbE tienen el mismo significado que anteriormente. 40

Los resultados figuran en el cuadro I siguiente. 2.4 Inhibici´ on de la 5’-lipoxigenasa

45

50

Como ya se ha expuesto m´ as arriba, la lipoxigenasa interviene en la formaci´on de mediadores de la inflamaci´ on, en particular los leucotrienos, a partir del a´cido araquid´ onico. En el ensayo de demostraci´ on de la inhibici´ on de esta enzima (C.W. Taylor, H.R. Morris, Brit. Med. Bull. (1989) 39, 219-222; J. Magee, Methods of Ezymathic Analysis, H.U. Bergmayer Ed., (1965) p. 411-4, Academic Press, N.Y.), se utiliza el a´cido linol´eico como substrato que se transforma en presencia de la enzima en ´acido 5-hidroper´ oxido-6,8,11,14-eicosatetraenoico (5 HPETE). Composici´ on del medio reactivo:

55

- ´acido linol´eico (substrato), soluci´ on 0,5 mM - tamp´ on borato 0,2 M a pH 9 - disolvente, con o sin efector al 0,5 %

: 2000 µl : 950 µl : 100 µl

en el tamp´ on borato 60

Para preparar la soluci´ on de a´cido linol´eico anterior, se realiza previamente una salificaci´on parcial del a´cido linol´eico en metanol en presencia de sodio, despu´es se introduce en el tamp´ on borato.

8

ES 2 176 808 T3 Se a˜ naden despu´es 100 µl de soluci´ on de la enzima 5’-lipoxigenasa en tamp´ on borato para la concentraci´on de 10 U/ml.

5

Como en los ensayos anteriores, se mide la absorbancia de los medios en funci´on del tiempo, y se calcula el porcentaje de inhibici´ on IL de la 5’-lipoxigenasa. Los resultados figuran en el cuadro I siguiente. CUADRO I

10

T´ıtulo de inhibici´ on de enzimas Elastasa IE

fosfolipasa A2 IP

5’-lipoxigenasa IL

EE

17 %

25 %

18 %

EM

72 %

22 %

32 %

ED

75 %

43 %

61 %

15

20

EE: extracto acuoso de o´leo-resina de okume, al 0,5 % en agua (disolvente) 25

EM: extracto metan´ olico de o´leo-resina de okume, al 0,5 % en metanol (disolvente) ED: extracto al DMSO de ´oleo-resina de okume al 0,5 % en DMSO (disolvente).

30

35

40

45

Los resultados obtenidos para la inhibici´on pueden considerarse como significativos para valores de inhibici´ on superiores al 25 %. La fracci´on de resina de okume extra´ıda por el DMSO presenta una actividad inhibidora muy significativa para las tres enzimas. La fracci´on metan´ olica presente en una actividad inhibidora equivalente a la de la fracci´on DMSO para la elastasa, as´ı como una actividad inhibidora notable para la 5’-lipoxigenasa. Por el contrario, esta fracci´on s´ olo es activa muy d´ebilmente sobre la inhibici´ on de la PLA2 . En cuanto a la fracci´on acuosa, s´ olo es inhibidora muy d´ebilmente para las tres enzimas ensayadas. Se debe concluir de estos resultados experimentales que los principios activos presentes en la resina de okume y los extra´ıdos por los disolventes org´ anicos ensayados no son extra´ıdos mediante disolventes demasiado polares tales como el agua. Estos resultados demuestran el inter´es de los extractos de resina de okume seg´un la invenci´ on, en los campos de la cosm´etica y de la farmacia, especialmente de la dermatolog´ıa, puesto que se trata de luchar contra los efectos negativos debidos a la acci´on de estas enzimas. Ejemplo 3 Protecci´ on de la queratina ungular

50

55

Se ponen 500 mg de fragmentos de u˜ nas previamente cortadas en presencia de queratinasa, con o sin extracto de resina de okume, durante 3 d´ıas en agitaci´on a 37◦C. Las muestras para la dosis de prote´ınas se efect´ uan a las 6, 12, 24, 48 y 72 horas y las prote´ınas alargadas se dosifican mediante la absorbancia. En estos ensayos, el extracto de resina de okume se prepara de conformidad con el ejemplo 1, y se utiliza en soluci´ on al 1 % en acetato de etilo. El cuadro 2 siguiente precisa la composici´ on de los medios reactivos para los ensayos realizados.

60

La soluci´on tamp´ on utilizada es una soluci´on tamp´ on tris-HCl 0,1 M, pH 7,5. La concentraci´on de las soluciones de enzima en el tamp´on es de 480 U/ml. La enzima se desactiva por calentamiento a 100◦C durante 10 minutos.

9

ES 2 176 808 T3 Se advierte que es necesario un ensayo “blanco enzima”, es decir, con la enzima desactivada, para poder tener en cuenta la absorbancia a 280 nm relacionada con el u ´nico aporte de enzima. CUADRO 2 5

10

Enzima blanca

Actividad basal

Tratamiento okume

U˜ na (mg)

500

500

500

Enzima desactivada

100 µl

-

-

Enzima activa

-

100 µl

100 µl

Acetato de etilo

200 µl

200 µl

-

Soluci´ on de extracto de okume

-

-

200 µl

Tamp´ on

1 ml

1 ml

1 ml

15

20

25

30

35

La cantidad de prote´ınas alargadas en el medio reactivo es proporcional a la absorbancia medida a 280 R . Los resultados de las mediciones de absorbancia se nm por medio de un espectrofot´ ometro Uvikon 941 muestran en la figura 1 en la cual la curva de puntos (curva 1) corresponde a la absorbancia en presencia s´olo de queratinasa y la curva en trazo continuo (curva 2), la absorbancia en presencia de queratinasa de extracto de okume. A las 24 h, la absorbancia del medio que contiene el extracto de okume es inferior en un 12 % a la del medio testigo (actividad basal). A las 48 h, la inhibici´ on es del 25 %, para estabilizarse aproximadamente en un 28 % a partir de las 72 h. Parece claramente seg´ un estos resultados que la presencia de extracto de resina de okume inhibe la acci´on de la queratinasa, protegiendo as´ı la queratina ungular. Ejemplo 4 Demostraci´ on del efecto film´ ogeno

40

45

Las observaciones realizadas con microscopio electr´ onico sobre los fragmentos de u˜ nas despu´es de permanecer 48 h en contacto con los medios reactivos del ensayo de inhibici´ on de la queratinasa descrito en el ejemplo anterior, permiten visualizar la diferencia entre una u˜ na testigo, una u˜ na expuesta a queratinasa con o sin tratamiento de protecci´ on de okume. Estos resultados aparecen claramente en las fotograf´ıas realizadas con microscopio electr´onico, por una parte de una u˜ na testigo (figura 2), por otra parte de una u˜ na tratada con queratinasa (figura 3) y por otra parte de una u˜ na tratada con queratinasa en presencia de resina de okume (figura 4). En estas fotograf´ıas, parece claramente que, la presencia de resina de okume no s´ olo protege la u˜ na del ataque de la queratinasa, sino que tambi´en le aporta un efecto film´ ogeno que se traduce en un aspecto m´as liso de la u˜ na. Ejemplo 5

50

55

Pomada dermatol´ogica para las u˜ nas - Extracto seco de resina de okume seg´ un el ejemplo 1 - Excipiente graso (alcoholes grasos polioxietilenos, glicerol, aceite de ma´ız inter-esterificado, lauril trihidroxi-3,4-5-benzoato, sorbitol, poliglicol estearato mixto, agua purificada)

0,5 g

qsp 100 g

Esta pomada puede aplicarse ma˜ nana y noche sobre las u˜ nas estropeadas, en particular como tratamiento de acompa˜ namiento anti-mic´ otico. 60

10

ES 2 176 808 T3 Ejemplo 6 Crema dermatol´ ogica para las u˜ nas 5

10

- Extracto seco de resina de okume seg´ un el ejemplo 1 - Sal de etanolamina del ciclopirox - Excipiente emulsivo de aceite en agua

1,0 g 1,0 g qsp 100 g

Esta crema que asocia un extracto de resina de okume y un agente anti-f´ ungico presenta un gran inter´es en el tratamiento de la onicomicosis por dermatofitos. Ejemplo 7 Gel cosm´etico anti-arrugas

15

20

25

-

Extracto seco de resina de okume, fracci´on metan´ olica seg´ un el ejemplo 2 Carbomero Glicerina EDTA tetras´odica Agua floral de hamamelis Polimetilmetacrilato Perfumes, conservantes, colorante, neutralizante Agua destilada

Este gel presenta un efecto anti-arrugas y tranquilizante. Ejemplo 8

30

B´ alsamo desenredante, para aclarar

35

-

Extracto seco de resina de okume seg´ un el ejemplo 1 Alcohol cetoestear´ılico + cetearil gluc´osido Cuaternio - 82 Cocamidopropilo betaina Neutralizante Perfumes, conservante, colorante Agua

40

Ejemplo 9

1,0 g 5,0 g 2,0 g 3,0 g qsp pH 5,5 qs qsp 100g

Crema anti-arrugas para la cara 45

50

55

-

Extracto seco de resina de okume seg´ un el ejemplo 1 Gliceril estearato + PEG 100 estearato Alcohol cet´ılico Cera de abeja Escualano Poliisobuteno hidrogenado Octanoato de cetearilo tricaprilato/capratode glicerol Dimeticona Goma xanteno Carbomero Glicerina Neutralizante, conservante, perfumes, colorantes Agua

60

11

0,5 g 5,0 g 1,0 g 1,50 g 3,0 g 4,0 g 1,50 g 3,0 g 1,0 g 0,2 g 0,15 2,0 qs qsp 100

0,05 g 0,3 g 3,0 g 0,05 g 3,00 g 1,00 g qs qsp 100 g

ES 2 176 808 T3 Ejemplo 10 Crema para pieles sensibles 5

10

15

-

Extracto seco de resina de okume, fracci´on metan´ olica seg´ un el ejemplo 2 Metilglucosa sesquiestearato Cera de abeja Alcohol beh´enico Octanoato de octilo Aceite mineral fluido Octanoato de cetosterarilo Glicerina Goma xanteno Perfumes Conservante, colorantes Agua

0,2 g 3,0 3,0 3,0 5,0 7,5 5,0 3,0 0,50 g 0,30 qs qsp 100

Ejemplo 11 20

Base tratante para las u˜ nas

25

30

35

-

Extracto seco de resina de okume al 10 % en acetato de etilo, seg´ un el ejemplo 1 Acetato de etilo Acetato de butilo Resina arilsulfonamida Alcanfor Nitrocelulosa al 70 % en isopropanol Dibutilftalato Estearalconio hectorito Soluci´ on a´cido c´ıtrico al 10 % en isopropanol Isopropanol

10 20,5 30,5 9,1 1,9 18,5 5,5 1,3 0,6 2,1

Ejemplo 12 Esmalte de u˜ nas tratante

40

45

50

-

Extracto seco de resina de okume al 10 % en acetato de etilo, seg´ un el ejemplo 1 Acetato de etilo Acetato de butilo Resina poli´ester Alcanfor Nitrocelulosa al 70 % en isopropanol Dibutilftalato Estearalconio hectorito Soluci´ on a´cido c´ıtrico al 10 % en isopropanol Isopropanol Pigmentos

55

60

12

20 10 30 9,1 1,9 18,5 5,5 1,3 0,6 2,1 1

ES 2 176 808 T3 REIVINDICACIONES 1. Composici´ on cosm´etica, caracterizada por el hecho de que contiene un extracto de resina de okume en presencia de un veh´ıculo cosm´eticamente aceptable. 5

10

15

20

2. Composici´ on seg´ un la reivindicaci´ on 1, caracterizada porque dicho extracto se obtiene por maceraci´on de dicha resina en un disolvente o una mezcla de disolventes, cuyo par´ametro de polaridad es inferior o igual a 6, seguida de una filtraci´ on y, si es necesario, de una evaporaci´ on del disolvente. 3. Composici´ on seg´ un la reivindicaci´ on 2, caracterizada porque dicho disolvente org´ anico se elige en el grupo constituido por hidrocarburos alif´ aticos en C6 a C12 tales como el hexano y el heptano, disolventes clorados, especialmente el diclorometano, ´eteres tales como el ´eter et´ılico o diisoprop´ılico, la acetona, ´esteres, tales como el acetato de etilo y el acetato de butilo, alcoholes en C1 a C4 , tales como el metanol, el etanol y el isopropanol. 4. Composici´ on seg´ un la reivindicaci´ on 1, caracterizada porque dicho extracto se obtiene por extracci´on al di´ oxido de carbono supercr´ıtico. 5. Composici´ on seg´ un una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque comprende del 0,01 % al 10 % en peso, y en particular del 0,2 % al 1 % en peso, de extracto seco de dicha resina. 6. Composici´ on seg´ un una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque comprende una cantidad eficaz de dicho extracto para conferir las cualidades film´ ogenas a dicha composici´on o mejorarlas.

25

30

35

7. Composici´ on seg´ un una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque se presenta en forma de crema, en particular para la cara o las manos, de gel, en particular un gel para el peinado, de b´ alsamo, especialmente un b´alsamo desenredante, de mascarilla, de base de maquillaje o de preparaci´on para las u˜ nas, como una base tratante o un esmalte para tratar las u˜ nas. 8. Utilizaci´on de un extracto de resina de okume como agente cosm´etico, estando dicho agente incorporado a una composici´ on cosm´etica tal como la definida en una de las reivindicaciones 1 a 7. 9. Utilizaci´on seg´ un la reivindicaci´ on 8, caracterizada porque dicho agente cosm´etico est´a incorporado a la composici´on en cantidad suficiente para conferir las cualidades film´ ogenas a la composici´on o mejorarlas. 10. Utilizaci´on seg´ un una de las reivindicaciones 8 ´o 9, caracterizada porque dicha composici´ on es una composici´ on de cuidado o de maquillaje.

40

11. Utilizaci´ on seg´ un una de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizada porque dicho agente cosm´etico contenido en la composici´on presenta una acci´on inhibidora de la queratinasa y/o de la elastasa y/o de la fosfolipasa A2 y/o de la lipoxigenasa.

45

12. Utilizaci´ on seg´ un una de las reivindicaciones 8 a 11, caracterizada porque dicha composici´ on est´a destinada al cuidado de las u˜ nas, del cabello o de las pesta˜ nas, en particular para mantenerlas en buen estado en cuanto a su estructura querat´ınica, para facilitar el peinado o para mejorar el maquillaje de las pesta˜ nas.

50

13. Utilizaci´ on seg´ un una de las reivindicaciones 8 a 12, caracterizada porque dicha composici´ on est´a destinada a luchar contra los efectos del envejecimiento de la piel, especialmente preservando o mejorando las calidades biomec´anicas de la piel, en particular su elasticidad, retrasando la aparici´ on de las arrugas o disminuyendo su profundidad, y mejorando la firmeza cut´ anea.

55

14. Utilizaci´ on seg´ un una de las reivindicaciones 8 a 13, caracterizada porque dicha composici´ on est´a destinada a luchar contra los efectos nocivos de los radicales libres sobre la piel, as´ı como al cuidado o al maquillaje de las pieles sensibles, especialmente atenuando o suprimiendo los fen´omenos de irritaci´on, de inflamaci´ on o de alergia, que se traducen generalmente a nivel cut´ aneo en rojeces, sensaciones de quemadura y picaz´ on.

60

15. Utilizaci´ on de un extracto de resina de okume para la preparaci´ on de una composici´ on farmac´eutica, especialmente dermatol´ogica, destinada a la prevenci´on o al tratamiento de las afecciones de los f´ aneros traduci´endose en una degradaci´ on de las estructuras querat´ınicas, al tratamiento de los efectos del envejecimiento intr´ınseco o act´ınico de la piel, al tratamiento de los efectos nocivos de los radicales 13

ES 2 176 808 T3 libres sobre la piel, a la prevenci´on o al tratamiento de las manifestaciones cut´ aneas de las alergias y de las inflamaciones, estando incorporado dicho extracto en un veh´ıculo farmac´euticamente aceptable.

5

16. Utilizaci´on seg´ un la reivindicaci´ on 15, caracterizada porque la composici´ on presenta una actividad inhibidora de la queratinasa y/o de la elastasa y/o de la fosfolipasa A2 y/o de la lipoxigenasa. 17. Utilizaci´ on seg´ un una de las reivindicaciones 15 ´o 16, caracterizada porque dicho extracto se utiliza para la preparaci´on de una composici´ on destinada al tratamiento o la prevenci´ on de las patolog´ıas de los f´aneros.

10

18. Utilizaci´on seg´ un una de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizada porque dicha composici´ on farmac´eutica contiene adem´as al menos una sustancia activa conocida por su actividad anti-f´ ungica, especialmente un agente activo sobre los dermatofitos responsables de la onicomicosis. 15

20

19. Utilizaci´ on seg´ un una de las reivindicaciones 15 a 18, caracterizada porque dicho extracto contenido en la composici´ on se obtiene siguiendo un proceso como el que se define en una de las reivindicaciones 2 a 4. 20. Utilizaci´on seg´ un una de las reivindicaciones 15 a 19, caracterizada porque dicha composici´ on contiene del 0,01 % al 10 % en peso, y en particular del 0,2 % al 1 % en peso, de extracto seco de dicha resina. 21. Utilizaci´on seg´ un una de las reivindicaciones 15 a 20, caracterizada porque dicha composici´ on se formula para una aplicaci´ on t´ opica sobre la piel o los f´ aneros.

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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