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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 206 602

51 Int. Cl. : C12N 15/12

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C07K 14/78 C07K 16/18 A61K 38/39 A61K 38/48

ESPAÑA

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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 96936842 .2

86 Fecha de presentación: 23.10.1996

87 Número de publicación de la solicitud: 0857210

87 Fecha de publicación de la solicitud: 12.08.1998

54 Título: Compuestos y métodos terapéuticos inhibidores de angiogénesis.

30 Prioridad: 23.10.1995 US 5835 P

02.08.1996 US 23070 P 17.09.1996 US 26263 P 22.10.1996 US 740168

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

16.05.2004

73 Titular/es:

The Children’s Medical Center Corporation 300 Longwood Avenue Boston, Massachusetts 02115, US

72 Inventor/es: O’Reilly, Michael, S. y

Folkman, M. Judah

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Durán Moya, Carlos

ES 2 206 602 T3

16.05.2004

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 206 602 T3 DESCRIPCIÓN Compuestos y métodos terapéuticos inhibidores de angiogénesis. 5

Sector técnico al que pertenece la invención

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La presente invención se refiere a un nuevo inhibidor de angiogénesis utilizable para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la angiogénesis, tales como cáncer dependiente de angiogénesis. La invención se refiere además a un nuevo compuesto y método para la curación de cáncer dependiente de angiogénesis. Además, la presente invención se refiere a ensayos de diagnóstico y a equipos para medición de endostatina, a equipos histoquímicos para la localización de la endostatina, a sondas moleculares para controlar la biosíntesis de la endostatina, a anticuerpos específicos para la endostatina, al desarrollo de agonistas de péptidos y antagonistas del receptor de endostatina, y a agentes citotóxicos relacionados con péptidos de endostatina.

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Antecedentes de la invención

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Varias líneas de pruebas directas sugieren en la actualidad que la angiogénesis esencial para el crecimiento y persistencia de tumores sólidos y sus metástasis (Folkman, 1989; Hori y otros, 1991; Kim y otros, 1993; Millauer y otros, 1994). Para estimular la angiogénesis, los tumores sobrerregulan su producción de una serie de factores angiogénicos, incluyendo los factores de crecimiento de fibroblastos (FGF y BFGF) (Kandel y otros, 1991) y factor de crecimiento celular endotelial vascular/factor de permeabilidad vascular (VEGF/VPF). No obstante, muchos tumores malignos generan también inhibidores de angiogénesis, incluyendo angiostatina y trombospondina (Chen y otros, 1995; Good y otros, 1990; O’Reilly y otros, 1994). Se ha hecho la hipótesis de que el fenotipo angiogénico es el resultado de un equilibrio neto entre estos reguladores positivos y negativos de la neovascularización (Good y otros, 1990; O’Reilly y otros, 1994; Parangi y otros, 1996; Rastinejad y otros, 1989). Otros varios inhibidores endógenos de angiogénesis han sido identificados si bien no todos están asociados con la presencia de un tumor. Entre éstos se incluyen el factor 4 de plaquetas (Gupta y otros, 1995; Maione y otros, 1990), interferón- alfa, proteína 10 inducible por interferón (Angiolillo y otros, 1995; Strieter y otros, 1995), que se induce por interleuquina 12 y/o interferón gamma (Voest y otros, 1995), gro-beta (Cao y otros, 1995), y el fragmento N-terminal de 16 kDa de prolactina (Clapp y otros, 1993). El único inhibidor conocido de angiogénesis que inhibe específicamente la proliferación de células endoteliales es la angiostatina (O’Reilly y otros 1994). La angiostatina es un inhibidor específico de la proliferación de células endoteliales de aproximadamente 38 kiloDaltons (kDa). La angiostatina es un fragmento interno de plasminógeno, que contiene, como mínimo, tres de los cinco “kringles” de plasminógeno. La angiostatina se ha demostrado que reduce el peso tumoral, y que inhibe la metástasis en ciertos modelos de tumor. (O’Reilly y otros, 1994). Tal como se utiliza en esta descripción, el término “angiostatina” se refiere a la angiostatina anteriormente descrita; fragmentos de péptidos de angiostatina que tienen actividad inhibidora de la proliferación de células endoteliales; y análogos de angiostatina que tienen homología de secuencia sustancial (tal como se define en esta memoria) con respecto a la secuencia de aminoácido de la angiostatina, que tienen actividad inhibidora de la proliferación de células endoteliales. Características de la invención

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La presente invención se refiere a un nuevo inhibidor de proteínas, y a un método de utilización del mismo. La proteína es un inhibidor potente y específico de la proliferación endotelial y de la angiogénesis. La terapia sistémica con el inhibidor provoca una supresión casi completa de angiogénesis inducida por tumor, y muestra fuerte actividad antitumoral.

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La proteína inhibitoria tiene un peso molecular de aproximadamente 18.000 hasta aproximadamente 20.000 Daltons (18 a 20 kDa) y es capaz de inhibir proliferación celular endotelial en células endoteliales de cultivo. La proteína puede ser caracterizada adicionalmente por su secuencia de aminoácido preferente N-terminal cuyos primeros veinte (20) son los siguientes:

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Un inhibidor de la proliferación celular endotelial preferente según la invención es una proteína que tiene las características antes descritas, y que se puede aislar y purificar de la línea celular hemangioendotelioma murino EOMA. Esta proteína inhibitoria ha sido designada endostatina. 2

ES 2 206 602 T3 La presente invención se refiere a una proteína endostatina aislada, en la que la proteína endostatina o fragmento de la misma es un fragmento de una zona C-terminal nocolágena de una proteína colágena y en la que la proteína endostatina, o fragmento de la misma, se caracteriza adicionalmente por su capacidad en inhibir angiogénesis. 5

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Rehn y otros (J. of Biol. Chem 269 (19): 13929-35, (1994)) y Sasaki y otros (EMBO J., 17(15): 4249-56 (1998)) han numerado las regiones C-terminal de colágeno XVIII utilizando diferentes nomenclaturas. La presente invención da a conocer métodos de compuestos para el tratamiento de enfermedades y procedimientos mediados por angiogénesis no deseada e incontrolada por la administración a humanos o animales afectados de la angiogénesis de un compuesto que comprende una endostatina sustancialmente purificada o derivado de la endostatina en una dosis suficiente para inhibir la angiogénesis. La presente invención es particularmente útil para el tratamiento o reducción del crecimiento de tumores. La administración de endostatina a humanos o animales con tumores en fase de metástasis prevascularizada impide el crecimiento o expansión de dichos tumores. La presente invención comprende también métodos de diagnóstico y equipos para la detección y medición de endostatina en fluidos biológicos y tejidos y para la localización de la endostatina en tejidos. El método de diagnóstico y equipo de diagnóstico puede adoptar cualquier configuración bien conocida por los técnicos de la materia. La presente invención comprende también anticuerpos específicos para la endostatina y anticuerpos que inhiben la unión de anticuerpos específicos para la endostatina. Estos anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos específicos para la endostatina pueden ser utilizados en equipos de diagnóstico para detectar la presencia y cantidad de endostatina que es diagnóstico o prognóstico de la existencia o de la recurrencia de cáncer u otras enfermedades mediadas por angiogénesis. También se pueden administrar anticuerpos específicos para endostatina a humanos o animales para inmunizar pasivamente a los mismos contra la endostatina, reduciendo de esta manera la inhibición angiogénica.

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La presente invención incluye también métodos de diagnóstico y equipos para detectar la presencia y cantidad de anticuerpos que se unen a endostatina en los fluidos corporales. El método de diagnóstico y su equipo pueden tener cualquier configuración de tipo bien conocido por los técnicos en la materia. 30

La presente invención comprende también fragmentos de péptido de endostatina que pueden ser marcados isotópicamente o con otras moléculas, o proteínas para su utilización en la detección y visualización de lugares de unión de endostatina con técnicas de tipo conocido, incluyendo, sin que ello sirva de limitación, tomografía de emisión de positrones, autorradiografía, citómetro de flujo, ensayos de unión de radiorreceptores, e inmunohistoquímica.

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Estos péptidos de endostatina actúan también como agonistas y antagonistas en el receptor de endostatina, aumentando de esta manera o bloqueando la actividad biológica de la endostatina. Estos péptidos son utilizados en el aislamiento del receptor de endostatina.

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La presente invención incluye también endostatina, fragmentos de endostatina, antisueros de endostatina o agonistas receptores de endostatina y antagonistas ligados a agentes citotóxicos para aplicaciones terapéuticas y de investigación. La presente invención comprende sondas moleculares para ácido ribonucleico y ácido deoxirribonucleico involucradas en la transcripción y traducción de endostatina. Estas sondas moleculares proporcionan medios de detección y medición de la biosíntesis de endostatina en tejidos y células. Un descubrimiento sorprendente es que varias formas de proteína de endostatina recombinante pueden servir como compuestos de liberación mantenida anti-angiogénesis cuando se administra un animal con tumor. Una forma preferente del compuesto de liberación mantenida es una endostatina no replegada producida recombinantemente.

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Adicionalmente la presente invención comprende secuencias de ácido nucleico que comprenden codones de núcleótidos correspondientes que codifican para la secuencia de aminoácido que se ha indicado anteriormente y para sus fragmentos de péptidos que inhiben la proliferación celular endotelial y endostatina. 55

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La presente invención se refiere también a métodos de utilización de la proteína de endostatina y fragmentos de péptidos que corresponden a secuencias de ácido nucleico, y anticuerpos que se unen específicamente al inhibidor y sus péptidos, para el diagnóstico de enfermedades y desórdenes relativos a células endoteliales. La presente invención comprende además un método para identificar receptores específicos para endostatina y moléculas receptoras identificadas y aisladas correspondientemente. La invención se refiere también a un método para identificar nuevas encimas capaces de liberar endostatina a partir de colágeno tipo XVIII, y otras moléculas que contienen una secuencia de aminoácido de endostatina, así como péptidos de la misma. Estas encimas productoras de endostatina constituyen también un aspecto de la invención.

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Un método médico importante es una nueva forma de control de natalidad, en el que una cantidad efectiva de endostatina es administrada a una hembra, de manera tal que se inhibe la vascularización endométrica uterina y no puede tener lugar o no se puede mantener la implantación embrional. 3

ES 2 206 602 T3

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Un aspecto importante específico de la presente invención es el descubrimiento de un método nuevo y efectivo para tratar enfermedades relacionadas con angiogénesis, particularmente cáncer dependiente de angiogénesis, en pacientes, y para la curación de cáncer dependiente de angiogénesis en pacientes. El método proporciona de manera inesperada el importante resultado médico de la inhibición de crecimiento tumoral y reducción de masa tumoral. El método se refiere a la coadministración de la endostatina de la presente invención y otro compuesto anti-angiogénesis, preferentemente angiostatina. De acuerdo con ello, la presente invención comprende también formulaciones que contienen endostatina, y opcionalmente angiostatina, que son eficaces para el tratamiento o curación de cánceres dependientes de angiogénesis. De acuerdo con lo anterior, es un objetivo de la presente invención dar a conocer un compuesto que comprende una proteína de endostatina. Otro objetivo de la presente invención consiste en dar a conocer un método para el tratamiento de enfermedades y procedimientos que son mediados por angiogénesis.

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Otro objetivo de la presente invención consiste en dar a conocer un método de diagnóstico o prognóstico y un equipo para detectar la presencia y cantidad de endostatina en un fluido o tejido corporal. 20

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Otro objetivo de la presente invención consiste en dar a conocer un método y compuesto para el tratamiento de enfermedades y procesos que son mediados por angiogénesis incluyendo, sin que ello sirva de limitación, hemangioma, tumores sólidos, leucemia, metástasis, telangiectasia psoriasis scleroderma, granuloma pirogénico, angiogénesis de miocardio, neovascularización de placas, colaterales coronarias, colaterales cerebrales, malformaciones arteriovenosas, angiogénesis isquémica de extremidades, enfermedades de la córnea, rubeosis, glaucoma neovascular, retinopatía diabética, fibroplasia retrolental, artritis, neovascularización diabética, degeneración macular, curación de heridas, úlcera péptica, fracturas, queloides, vasculogénesis, hematopoyesis, ovulación, menstruación, y placentación. Otro objetivo de la presente invención consiste en dar a conocer un compuesto para el tratamiento o reducción del crecimiento del cáncer.

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Un objetivo de la presente invención consiste en dar a conocer un método para la detección y cuantificación de la presencia de un anticuerpo específico para una endostatina en el fluido corporal. Otro objetivo de la presente invención consiste en dar a conocer un compuesto que consiste en anticuerpos de endostatina que son selectivos para regiones específicas de la molécula de endostatina.

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Otro objetivo de la presente invención consiste en dar a conocer un método para la detección o prognosis de cáncer. Otro objetivo de la presente invención consiste en dar a conocer un compuesto para su utilización en la visualización y cuantificación de lugares de unión de endostatina in vivo y in vitro. 40

Otro objetivo de la presente invención consiste en dar a conocer un compuesto para su utilización en la detección y cuantificación de la biosíntesis de la endostatina. 45

Otro objetivo de la presente invención consiste en dar a conocer una terapia para cáncer que tiene efectos secundarios mínimos. Otro objetivo de la presente invención consiste en dar a conocer un compuesto que comprende endostatina o un péptido de endostatina asociado a un agente citotóxico para el tratamiento o represión del crecimiento de cáncer.

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Éstos y otros objetivos, características y ventajas de la presente invención quedarán evidentes después de la lectura de la descripción detallada siguiente de las realizaciones que se dan a conocer y de las reivindicaciones adjuntas. Breve descripción de las figuras

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Figura 1 Inhibición de proliferación celular endotelial capilar por medios condicionados a partir de células EOMA

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Medios condicionados recogidos de células EOMA confluentes o medios de base se aplicaron a células endoteliales capilares bobinas con 1 ng/ml bFGF en un ensayo de proliferación de 72 horas. La proliferación de células endoteliales fue inhibida por los medios condicionados de EOMA. Cada una de las barras representa el ± SEM medio.

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ES 2 206 602 T3 Figura 2 Purificación de un inhibidor de proliferación endotelial a partir de medios condicionados de EOMA 5

Los medios condicionados recogidos de células EOMA confluentes fueron fraccionados sobre una columna de sefarosa de heparina. La actividad de inhibición de proliferación endotelial se eluyó aproximadamente a 0,8M NaCl. Figura 3

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Purificación de un inhibidor de proliferación endotelial por filtración de gel Se aplicó un inhibidor purificado procedente de cromatografía de columna de sefarosa de heparina a una columna de filtración de gel y se eluyó como pico único.

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Figura 4 Purificación de inhibidor de proliferación celular endotelial por cromatografía de columna de fase inversa

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Se aplicó inhibidor purificado por sefarosa de heparina y cromatografía de filtración de gel a una columna de fase inversa. El inhibidor eluyó como banda única de la columna aproximadamente a 45% del acetonitrilo. Figura 5 Secuencia N-terminal de aminoácidos de un inhibidor de proliferación de células endoteliales

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La secuencia N-terminal de un inhibidor purificado de proliferación celular endotelial se ha mostrado en relación con el diagrama esquemático de colágeno tipo 18. La secuencia N-terminal reveló identidad del inhibidor aproximadamente con un fragmento C-terminal de 20 kDa (mostrado en sombreado lleno) para colágeno tipo XVIII. Las casillas abiertas representan los dominios de colagenasa de colágeno tipo XVIII. 30

Figura 6 Tratamiento del carcinoma de pulmón de Lewis con inhibidor de endostatina de ratón recombinante 35

Se administró inhibidor recombinante producido en E. coli a ratones sometidos a carcinoma de Pulmón de Lewis que habían llegado a un volumen tumoral aproximadamente de 150 mm3 . El inhibidor fue administrado a una dosis de 20 mg/kg/día. La masa tumoral disminuyó hasta niveles no detectables después de aproximadamente 12 días de tratamiento.

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Figuras 7A-C La terapia sistémica con endostatina recombinante reduce tumores primarios de carcinoma de pulmón de Lewis

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Figura 7A. Se implantó a ratones subcutáneamente en el dorso células de carcinoma de pulmón de Lewis. Se empezó la terapia sistémica con endostatina de ratón recombinante (20 mg/kg/día) cuando los tumores tenían aproximadamente un volumen de 200 mm3 (1% de peso corporal). Los tumores en los ratones tratados con inhibidor de endostatina disminuyeron con rapidez y se inhibieron aproximadamente >99% con respecto a controles tratados con solución salina. Cada punto representa ± SEM medio para 5 ratones. El experimento fue repetido con resultados comparables.

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Figura 7B. Ratones representativos portadores de tumor con y sin tratamiento después de 11 días de terapia sistémica con endostatina. Los ratones tratados con solución salina (derecha) presentaron tumores de color rojo con crecimiento rápido y superficies ulceradas. Los ratones tratados con endostatina (izquierda) tenían tumores residuales pequeños de color pálido (flecha). 55

Figura 7C. Enfermedad residual de ratones tratados con endostatina. Tres de los cinco ratones tratados con endostatina fueron sacrificados después de 16 días de terapia. La autopsia reveló pequeños tumores residuales blancos en el lugar de la implantación primaria original (flechas). 60

Figura 8 Tratamiento de Fibrosarcoma Murino T241 con endostatina de ratón recombinante procedente de E. coli

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Se sometieron los ratones a la acción de células de Fibrosarcoma T241. Los ratones de control fueron tratados con solución salina. Los ratones del experimento fueron tratados con 20 mg/kg/día de endostatina de ratón recombinante dirigida de E. coli.

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ES 2 206 602 T3 Figura 9 Tratamiento de Melanoma B16f10 Murino con endostatina de ratón recombinante procedente de E. coli 5

Ratones sometidos a células de Melanoma B16F10 Murino. Los animales de control fueron tratados con solución salina. Los animales del experimento fueron tratados con 20 mg/kg/día de Endostatina de Ratón Recombinante directamente procedente de E. coli. Figura 10

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Tratamiento de hemangioendotelioma EOMA con endostatina de ratón recombinante procedente de E. coli

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Se trataron ratones con células de hemangioendotelioma EOMA. Los animales de control fueron tratados con solución salina. Los animales del experimento fueron tratados con 20 mg/kg/día de Endostatina de Ratón Recombinante directamente procedente de E. coli. Figura 11

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Tratamiento de carcinoma de pulmón de Lewis con endostatina de ratón recombinante o humana directamente de E. coli Se sometieron ratones a células de Carcinoma de Pulmón de Lewis. Los animales de control fueron tratados con solución salina. Los animales del experimento fueron tratados con Endostatina Recombinante derivada de la secuencia de ratón o Endostatina Recombinante directa de secuencia humana, de manera que ambas Endostatinas fueron producidas por vía Recombinante en E. coli. Se administró Endostatina de Ratón a 20 mg/kg/día o 2,5 mg/kg/día, y se administró Endostatina humana a 20 mg/kg/día. Figuras 12A-C

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Resultados de endostatina en la inhibición de angiogénesis e incremento de apoptosis de tumores primarios de carcinoma de pulmón de Lewis Secciones histológicas de tumores de ratones tratados con solución salina en comparación con ratones tratados con endostatina, con implantación de carcinomas de pulmón de Lewis, fueron analizadas en cuanto a proliferación (PCNA), apoptosis (TUNEL), y angiogénesis (vWF). No se observó diferencia significativa en el índice de proliferación de células tumorales (figura 12A) en tumores tratados con respecto a tumores sin tratamiento. Como contraste, el índice apoptótico de células tumorales (figura 12B) incrementó 8 veces (p < 0,001) en los ratones tratados con endostatina. La densidad de vasos (figura 12C) fue determinada por contaje del número de vasos sanguíneos capilares por campo de alta potencia (HPF) en secciones con tinción de anticuerpos contra vWF. La angiogénesis se había suprimido casi completamente en los tumores microscópicos residuales de los ratones tratados con endostatina (p < 0,001). Figura 13

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Terapia de ciclo durmiente de carcinoma de pulmón de Lewis con endostatina de ratón recombinante procedente de E. coli

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Se implantaron ratones con células de carcinoma de pulmón de Lewis de forma subcutánea en el dorso. Se empezó terapia sistémica con inhibidor de ratón recombinante (endostatina), administrada en una dosis de 20 mg/kg/día, cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 200 mm3 (1% de peso corporal). Los tumores en los ratones tratados con el inhibidor de endostatina se redujeron con rapidez esencialmente a niveles no detectables después de unos 15 días de tratamiento. Cuando se terminó el tratamiento, el volumen del tumor aumentó rápidamente y fue tratable a continuación a los mismos niveles no detectables al reiniciar el tratamiento. Los picos y valles de la figura muestran el efecto cíclico de la inhibición con endostatina.

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Figura 14 Terapia de combinación con angiostatina de ratón recombinante y endostatina procedentes de E. coli

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Se implantaron ratones por vía subcutánea en el dorso con células de carcinoma de pulmón de Lewis. Se inició la terapia sistémica con una combinación de endostatina de ratón recombinante (20 mg/kg/día) y angiostatina del ratón recombinante (20 mg/kg/día) cuando los tumores alcanzaron el volumen aproximado de 300 mm3 . Los tumores de los ratones tratados con la terapia de combinación se redujeron rápidamente esencialmente a nivel no detectable en unos 15 días. De forma importante, los tumores que habían sido reducidos permanecieron durmientes y no aumentaron su tamaño o masa después de interrumpir el tratamiento. Éste es un resultado no esperado de sustancial significación médica.

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ES 2 206 602 T3 Descripción detallada de la invención

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Los solicitantes han descubierto una nueva clase de moléculas de proteína que tienen capacidad de inhibir la proliferación endotelial cuando se añaden a células endoteliales proliferantes in vitro. De acuerdo con ello, estas moléculas de proteína han sido definidas funcionalmente como endostatinas, no obstante, se debe comprender que esta definición funcional no limita en modo alguno a la bioactividad de las endostatinas en cuanto a la inhibición de crecimiento celular endotelial in vitro o in vivo. Son posibles muchas otras funciones de las endostatinas. El término “endostatina” se refiere a una proteína que tiene dimensiones preferentemente de 18 kDa a 20 kDa determinadas por electroforesis de gel no reducido y reducido, respectivamente. El término endostatina incluye también formas precursoras de la proteína de 18 kDa a 20 kDa. El término endostatina comprende también fragmentos de la proteína de 18 kDa a 20 kDa y proteínas y péptidos modificados que tienen una secuencia aminoácida similar, y que son capaces de inhibir la proliferación de células endoteliales. Por ejemplo, las sustituciones silenciosas de aminoácidos, en las que la sustitución de un aminoácido por un aminoácido estructural o químicamente similar no significa la alteración de la estructura, conformación o actividad de la proteína, tal como es bien conocido en esta técnica. Estas sustituciones silenciosas están destinadas a quedar comprendidas dentro del ámbito de las reivindicaciones adjuntas. Se apreciará que el término “endostatina” incluye proteínas acortadas o péptidos en los que uno o varios aminoácidos han sido eliminados de cualquier extremo o de ambos de la endostatina o de una región interna de la proteína, no obstante, la proteína resultante retiene la actividad inhibidora de proliferación endotelial. El término “endostatina” incluye también proteínas o péptidos alargados en los que se añaden uno o varios aminoácidos a uno o ambos extremos de la endostatina o a un lugar interno de la proteína, pero que no obstante la molécula resultante conserva la actividad inhibidora de proliferación endotelial. Estas moléculas, por ejemplo con añadidura de tirosina en la primera posición, son útiles para marcado, tal como radio-iodado con 125 iodo para utilización en ensayos. El marcado con otros radioisótopos puede ser útil para conseguir una herramienta molecular para destruir la célula objetivo que contiene receptores de endostatina. Otros marcadores con moléculas tales como ricina pueden proporcionar un mecanismo para destruir células con receptores de endostatina. “Homología de secuencia sustancial” significa, como mínimo, aproximadamente una homología de 70% entre una secuencia de residuo de aminoácido en la secuencia análoga de endostatina, y la de endostatina preferentemente, como mínimo, una homología de 80% aproximadamente, más preferentemente una homología de 90% aproximadamente, como mínimo. Se incluyen también en la definición de un término endostatina modificaciones de la proteína de endostatina, sussubunidades y fragmentos de péptido. Estas modificaciones incluyen sustituciones de aminoácidos naturales en lugares específicos con otras moléculas, incluyendo sin que ello sirva de limitación, aminoácidos naturales y no naturales. Estas sustituciones pueden modificar la bioactividad de la endostatina y producir agonistas biológicos o farmacológicos o antagonistas. El término endostatina incluye también un fragmento de terminal N de la endostatina que consiste en la secuencia de los primeros 20 aminoácidos N terminales que se muestra en la SEQ ID NO:1 y que se muestra en la Tabla 1. Esta secuencia de los primeros 20 aminoácidos de terminal N corresponde a un fragmento de terminal C del colágeno de nueva identificación tipo XVIII.

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La Tabla 1 muestra la correspondencia de las designaciones de aminoácidos con 3 letras y 1 letra. TABLA 1 45

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Aminoácido

Residuo

Abreviatura

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

HIS THR HIS GLN ASP PHE GLN PRO VAL LEU HIS LEU VAL ALA LEU

H T H Q D F Q P V L H L V A L

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ES 2 206 602 T3 TABLA 1 (continuación)

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Aminoácido

Residuo

Abreviatura

16 17 18 19 20

ASN THR PRO LEU SER

N T P L S

La secuencia de aminoácido de terminal N de la endostatina corresponde a un fragmento de péptido de 20 aminoácidos interno hallado en el colágeno de ratón alfa 1 tipo XVIII, iniciándose en el aminoácido 1105 y terminando en el aminoácido 1124. La secuencia del aminoácido de terminal N del inhibidor corresponde también a un fragmento de péptido de 20 aminoácidos interno hallado en el colágeno humano alfa 1 tipo XVIII, iniciándose en el aminoácido 1132 y terminando en el aminoácido 1151. La endostatina puede ser aislada a partir de hemangioendotelioma EOMA murino. La endostatina puede ser producida a partir de fuentes recombinantes, a partir de células alteradas genéticamente implantadas en animales, de tumores, y de cultivos celulares, así como otras fuentes. Se prevé que la endostatina es realizada en células del sistema nervioso. La endostatina puede ser aislada de fluidos corporales que incluyen, sin que sirva de limitación, suero, orina y ascitos, o se pueden sintetizar por métodos químicos o biológicos (por ejemplo, cultivo celular, expresión de genes recombinantes, síntesis de péptidos y catálisis enzimática in vitro de moléculas precursoras para conseguir la endostatina activa). Las técnicas recombinantes comprenden amplificación de genes de fuentes de ADN utilizando la reacción de cadena de polimerasa (PCR), y amplificación de genes de fuentes ARN utilizando transcriptasa inversa/PCR. La endostatina inhibe de manera específica y reversible la proliferación celular endotelial. Las moléculas de proteínas del inhibidor de la invención se utilizan como medicamento de control de natalidad, y para tratar enfermedades relacionadas con angiogénesis, particularmente cánceres y tumores dependientes de angiogénesis. Las moléculas de la proteína son también útiles para curar cánceres dependientes de angiogénesis y tumores. La capacidad inesperada y sorprendente de estos nuevos compuestos para tratar y curar cánceres y tumores dependientes de angiogénesis, satisface una necesidad insatisfecha hasta el momento en medicina y proporciona importantes ventajas al género humano. Términos importantes que se utilizan en esta descripción se definirán de la manera siguiente. “Cáncer” significa cánceres y tumores dependientes de angiogénesis, es decir, tumores que requieren para su crecimiento (expansión en volumen y/o masa) un incremento del número y densidad de los vasos sanguíneos que les alimentan de sangre. “Reducción” significa la reducción de masa y dimensiones del tumor. Las proteínas que inhiben la proliferación endotelial en la presente invención se pueden preparar por métodos de síntesis de proteínas automatizados bien conocidos para los expertos en la materia. De manera alternativa, las proteínas inhibidoras de la proliferación endotelial, o endostatinas de la presente invención se pueden aislar de proteínas conocidas más grandes, tales como colágeno humano alfa 1 tipo XVIII y colágeno de ratón alfa 1 tipo XVIII, proteínas que comparten una secuencia de aminoácidos de terminal N común o similar. Se incluyen entre los ejemplos de otras fuentes de endostatinas potenciales que tienen secuencias de aminoácidos N terminales similares, la esterasa pregástrica Bos taurus, colágeno humano alfa 1 tipo 15, dehidrogenasa formato dependiente de NAD (EC 1.2.1.2) derivada de Pseudomonas sp., proteína hexon s11459 de adenovirus bovino tipo 3, producto de genes CELF21D12 2 F21d12.3 Caenorhabditis elegans, proteína VAL1 TGMV AL1 derivada de virus mosaico dorado del tomate, proteína hexon S01730 derivada de adenovirus 12 humano, Saccharomyces cerevisiae. Por ejemplo, péptidos íntimamente relacionados con la endostatina pueden ser derivados de la secuencia de genes de esterasa pregástrica BOVMPE 1 (BOS TAURUS) correspondiente a los aminoácidos 502 a 521, y el colágeno alfa 1 tipo 15 de humanos empezando en el aminoácido 316 y terminando en el 335. Las proteínas y péptidos derivados de éstas y de otras fuentes, incluyendo síntesis de proteínas de forma manual o automatizada, se pueden comprobar de manera fácil y rápida en cuanto a actividad inhibidora de la proliferación endotelial utilizando una serie de actividad biológica, tal como el ensayo de proliferación celular endotelial de capilares bovinos. Otros bioensayos de actividad inhibidora incluyen el ensayo CAM de pollo, el ensayo corneal de ratón, y el efecto de administrar proteínas aisladas o sintéticas en tumores implantados. El ensayo CAM de pollo es descrito por O’Reilly, y otros en “Angiogenic Regulation of Metastatic Growth” Cell, vol. 79 (2), 21 de octubre de 1994, páginas 315-328, que se incorpora como referencia en su totalidad a la presente descripción. De modo breve, embriones de pollo de 3 días con yemas intactas son separados del huevo y situados en un plato petri. Después de 3 días de incubación se aplica un disco de metilcelulosa que contiene la proteína a comprobar al CAM de los embriones individuales. Después de 48 horas de incubación, los embriones y los CAMs son observados para determinar si se ha inhibido el crecimiento endotelial. El ensayo corneal de ratón comporta la implantación de una pastilla que contiene factor de crecimiento junto con otra pastilla que contiene el inhibidor de crecimiento endotelial supuesto, en la córnea del ratón y observar el modelo de los capilares que se elaboran en la córnea. 8

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La invención presente también alarga las secuencias de ácido nucleico que corresponden y clasifican para las moléculas de proteína de inhibición de proliferación endotelial de la invención, y anticuerpos monoclonales y policlonales que se unen específicamente a dichas moléculas de proteína. Las moléculas de proteína biológicamente activa, secuencias de ácido nucleico que corresponden a las proteínas, y anticuerpos que se unen específicamente a las proteínas de la presente invención son útiles para modular los procesos endoteliales in vivo y para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades relacionadas con las células endoteliales, por ejemplo, por terapia de genes. Las secuencias de ácido nucleico que corresponden y que codifican para endostatina y análogos de endostatina se pueden preparar basándose en el conocimiento de la secuencia de aminoácido y la correspondencia reconocida en esta técnica entre codones (secuencias de tres bases de ácido nucleico), y aminoácidos. A causa de la degeneración del código genético, según la cual la tercera base de un codón puede variar pero codificar todavía para el mismo aminoácido, muchas secuencias de ácido nucleico con distinta codificación posible son derivables para cualquier proteína o fragmento de péptido específicos. Las secuencias de ácido nucleico son sintetizadas utilizando sistemas automatizados bien conocidos en esta técnica. Se puede sintetizar la secuencia completa o bien se puede preparar una serie de pequeños oligonucleótidos y posteriormente proceder a su ligado junto para conseguir la secuencia de longitud completa. De manera alternativa la secuencia de acción nucleico puede ser derivada de un banco de genes utilizando sondas de oligonucleótidos diseñadas basándose en la secuencia de minoácidos en el terminal N y técnicas bien conocidas para el clonado de material genético. La presente invención comprende también la detección de endostatina en fluidos y tejidos corporales con el objetivo de efectuar el diagnóstico o prognóstico de enfermedades mediadas por angiogénesis, tales como cáncer. La presente invención comprende también la detección de lugares de unión de endostatina y receptores en células y tejidos. La presente invención incluye también métodos de tratamiento o prevención de enfermedades angiogénicas y procesos que incluyen, sin que haya sido de limitación, artritis y tumores por estimulación de la producción de endostatina y/o por administración de endostatina sustancialmente purificada, o agonistas o antagonistas de endostatina y/o antisueros de endostatina o antisueros dirigidos contra antisueros de endostatina en un paciente. Los métodos de tratamiento adicionales comprenden la administración de endostatina, fragmentos de endostatina, antisueros de endostatina o agonistas receptores de endostatina y antagonistas ligados a agentes citotóxicos. Se debe comprender que la endostatina puede ser animal o humana por su origen. La endostatina también puede ser producida sintéticamente por reacción química o por técnicas recombinantes conjuntamente con sistemas de expresión. También se puede producir una endostatina enzimáticamente accionando diferentes moléculas, incluyendo precursores de endostatina, conteniendo homología de secuencia o identidad con segmentos de endostatina para generar péptidos que tienen actividad antiangiogénesis.

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La terapia de anticuerpos pasivos utilizando anticuerpos que específicamente se unen con endostatina se pueden utilizar para modular los procesos dependientes de endotelio, tales como reproducción, desarrollo y curación de heridas y reparación de tejidos. Además, se pueden administrar antisueros dirigidos a las regiones Fab de anticuerpos de endostatina para bloquear la capacidad de antisueros de endostatina endógenos en unirse a la endostatina. 40

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Se preparan anticuerpos específicos para la endostatina y análogos de la endostatina de acuerdo con técnicas y protocolos bien conocidos en esta técnica. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. Los anticuerpos son utilizados en formatos de inmunoensayo bien conocidos, tales como inmunoensayos competitivos y no competitivos, incluyendo ensayo ELISA, inmunoensayos “sandwich” y radioinmunoensayos (RIAs), para determinar la presencia o ausencia de inhibidores de proliferación endotelial de inhibidores de proliferación endotelial de la presente invención en fluidos corporales. Entre los ejemplos de fluidos corporales se incluyen, sin que ello sirva de limitación, sangre, suero, fluido peritoneal, fluido pleural, fluido cerebroespinal, fluido uterino, saliva, y moco. Las proteínas, secuencias de acción nucleico y anticuerpos de la presente invención son útiles para diagnóstico y tratamiento de enfermedades y desórdenes relacionados con células endoteliales. Un proceso de células endoteliales especialmente importantes es la angiogénesis, formación de vasos sanguíneos. Las enfermedades relacionadas con angiogénesis se pueden diagnosticar y tratar utilizando las proteínas de inhibición de proliferación de células endoteliales de la presente invención. Las enfermedades relacionadas con angiogénesis incluyen, sin que sirva de limitación, cáncer dependiente de angiogénesis incluyendo, por ejemplo, tumores sólidos, tumores originados de la sangre, tales como leucemias y metástasis tumorales; tumores benignos, por ejemplo, hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas, y granulomas pirogénicos; artritis reumatoide; psoriasis; enfermedades angiogénicas oculares, por ejemplo, retinopatía diabética, retinopatía de premadurez, degeneración macular, rechazo de injerto corneal, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis; Síndrome de Osler-Webber; angiogénesis de miocardio; neovascularización de placas; telangiectasia; articulaciones hemofílicas; angiofibroma; y granulación de heridas. Las proteínas inhibidoras de proliferación de células endoteliales según la presente invención son útiles en el tratamiento de enfermedades de estimulación anormal o excesiva de las células endoteliales. Estas enfermedades incluyen, sin que ello sirva de limitación, adherencias intestinales, aterosclerosis, escleroderma, y heridas hipertróficas, es decir, queloides. Son también útiles en el tratamiento de enfermedades que tienen angiogénesis como consecuencia patológica, tales como la enfermedad de arañazos de gato (Rochele minalia quintosa) y úlceras (Helobacter pylori).

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Las proteínas inhibidoras de proliferación celular endotelial pueden ser utilizadas como agente de control de natalidad al reducir o impedir la vascularización uterina requerida para la implantación del embrión. Por lo tanto, la presente invención da a conocer un método efectivo de control de natalidad cuando se administra a una hembra una 9

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cantidad de la proteína inhibitoria suficiente para impedir la implantación del embrión. Según un aspecto del método de control de natalidad, una cantidad de proteína inhibidora, suficiente para bloquear la implantación del embrión, es administrada antes o después de que haya tenido lugar el coito y fertilización, proporcionando de esta manera un método eficaz de control de natalidad, posiblemente un método del “día después”. Si bien no se desea quedar limitado por esta afirmación, se cree que la inhibición de la vascularización del endometrio uterino interfiere con la implantación del blastocito. Una inhibición similar de vascularización de la mucosa del tubo uterino interfiere con la implantación del blastocito, impidiendo que ocurra una gravidez tubal. Los métodos de administración pueden comprender, sin que constituya limitación, pastillas, inyecciones (intravenosa, subcutáneas, intramuscular), supositorios, esponjas vaginales, tampones vaginales, y dispositivos intrauterinos. Se cree también que la administración de endostatina interferirá con la vascularización incrementada normal de la placenta y asimismo con el desarrollo de vasos con un blastocito implantado satisfactoriamente y con el desarrollo del embrión y el feto. Inversamente, el bloque de receptores de endostatina con análogos de endostatina que actúan como antagonistas receptores puede ayudar a la endotelialización y a la vascularización. Estos efectos pueden ser deseables en situaciones de vascularización no adecuada del endometrio uterino e infertilidad asociada, reparación de heridas, curación de corte e incisiones, tratamiento de problemas vasculares en diabéticos, especialmente en vasos de la retina y periféricos, ayuda a la vascularización en tejidos transplantados, incluyendo músculos y piel, ayuda de vascularización de músculo cardíaco especialmente después de transplante de corazón o tejidos cardíacos y después de cirugía por bypass, ayuda de vascularización de tumores sólidos relativamente avasculares para aumentar el suministro de citotoxina, y aumento del flujo sanguíneo al sistema nervioso incluyendo, sin que sirva de limitación, el cortex cerebral y médula espinal. Un descubrimiento sorprendente es que la endostatina recombinante no replegada y no soluble es también un potente compuesto anti-angiogénesis que sirve como depósito para liberación mantenida cuando se administra a un paciente.

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La presente invención se refiere también a métodos de utilización de endostatina, y fragmentos de péptidos de endostatina inhibidores de la proliferación de células endoteliales, secuencias de ácidos nucleicos que corresponden a la endostatina y fragmentos de péptidos activos de los mismos, así como anticuerpos que aseguran específicamente a la endostatina y sus péptidos, para diagnositcar enfermedades y desórdenes relacionados con células endoteliales. 30

La presente invención comprende además un método para la identificación de receptores específicos de endostatina y las moléculas receptoras identificadas y aisladas de este modo. La presente invención da a conocer también un método para la cuantificación de receptores de endostatina. 35

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Un aspecto especialmente importante de la presente invención es el descubrimiento de un método nuevo y efectivo para tratar y curar cáncer dependiente de angiogénesis en pacientes. Se ha descubierto de manera inesperada que la coadministración de endostatina y de angiostatina en una cantidad suficiente para inhibir el crecimiento tumoral y para provocar una regresión mantenida de la masa tumoral a dimensiones microscópicas, cura un cáncer dependiente de angiogénesis. De acuerdo con ello, la presente invención incluye también formulaciones efectivas por el tratamiento o curación de cánceres y tumores dependientes de angiogénesis. Más particularmente, la endostatina de ratón recombinante, procedente de células de insectos o E. coli, inhibe de manera potente la angiogénesis y el crecimiento de metástasis y de tumores primarios. En un nuevo método de liberación mantenida, la endostatina recombinante derivada de E. coli fue administrada como suspensión no replegada en una cantidad suficiente para inhibir la angiogénesis inhibiendo, por lo tanto, el crecimiento tumoral. La masa tumoral fue reducida cuando se administró endostatina recombinante en una cantidad suficiente para provocar la regresión del tumor. Tumores primarios de 1-2% del peso corporal se redujeron en proporciones que llegaban a 150 veces pasando a ser lesiones microscópicas durmientes una vez tratadas por endostatina. Los análisis inmunohistoquímicos de los tumores durmientes han revelado angiogénesis bloqueada acompañada por alta proliferación de células tumorales equilibrada por una elevada tasa de apóptosis de células tumorales. No hay pruebas de toxicidad en ninguno de los ratones tratados con endostatina. Se prevé como parte de la presente invención que la endostatina puede ser aislada de un fluido corporal, tal como sangre u orina de pacientes o bien que la endostatina puede ser producida por métodos de ADN recombinante o métodos químicos de péptido sintéticos bien conocidos por los técnicos en la materia. Los métodos de purificación de proteínas son bien conocidos en esta técnica, y un ejemplo específico de un método para la purificación de endostatina y de ensayar la actividad inhibitoria se ha indicado en los ejemplos siguientes. El aislamiento de la endostatina endógena humana se consigue utilizando técnicas similares.

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Un ejemplo de un método de producción de endostatina utilizando técnicas de ADN recombinante comporta las etapas (1) identificar y purificar una endostatina, tal como se ha indicado anteriormente, y tal como se describirá de manera más completa más adelante, (2) determinar la secuencia de aminoácidos N- terminal del inhibidor purificado, (3) generar sintéticamente una sonda de oligonucleótico de ADN que corresponde a la secuencia de aminoácidos en el terminal N, (4) generar un banco de genes de ADN procedentes de ADN humano o de otros mamíferos, (5) sondar el banco de genes con una sonda de oligonucleótidos de ADN, (6) seleccionar clones que hibridizan al oligonucleótido, (7) aislar el gen inhibidor del clon, (8) insertar el gen en un vector apropiado, tal como un vector de expresión, (9) insertar el vector que contiene el gen en un microorganismo u otro sistema de expresión capaz de expresar el gen 10

ES 2 206 602 T3 inhibidor, y (10) aislar el inhibidor producido de forma recombinante. Las técnicas anteriores se describen de manera más completa en manuales de laboratorio, tales como “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Segunda Edición, de Sambrook y otros, Cold Spring Harbor Press, 1989. 5

El gen para endostatina también puede ser aislado a partir de células o tejidos (tales como células tumorales) que expresan elevados niveles de endostatina por medio de (1) aislar el ARN mensajero con respecto al tejido, (2) utilizar transcriptasa inversa para generar la secuencia de ADN correspondiente y a continuación (3) utilizar PCR con los cebadores apropiados para amplificar la secuencia de ADN que codifica para la secuencia de aminoácido de endostatina activa.

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Otro método para la producción de endostatina o fragmentos biológicamente activos de la misma es por síntesis de péptido. Una vez que se ha hallado un fragmento biológicamente activo de una endostatina utilizando el sistema de ensayo descrito de manera más completa más adelante, se puede secuenciar, por ejemplo, por métodos de secuenciado de péptidos automatizados. De manera alternativa, una vez que el gen o secuencia de ADN que codifica para endostatina es aislado, por ejemplo, por los métodos descritos anteriormente, la secuencia de ADN puede ser determinada proporcionando a su vez información con respecto a la secuencia de aminoácido. Por lo tanto, si el fragmento biológicamente activo es generado por métodos específicos, tales como digestos trípticos, o si el fragmento es secuenciado en el terminal N, la secuencia de aminoácidos restante se puede determinar a partir de la secuencia de ADN correspondiente.

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Una vez conocida la secuencia de aminoácido del péptido, por ejemplo, los 20 aminoácidos del terminal N, el fragmento puede ser sintetizado por técnicas bien conocidas en este sector, por ejemplo, las que se indican en la obra “Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach” E. Atherton and R.C. Sheppard, IRL Press, Oxford, Inglaterra. De modo similar, múltiples fragmentos pueden ser sintetizados, los cuales a continuación son enlazados entre sí para formar fragmentos más grandes. Estos fragmentos de péptidos sintéticos pueden ser también preparados con sustituciones de aminoácidos en lugares específicos a efectos de probar la actividad agonística y antagonística in vitro y in vivo. Se pueden utilizar fragmentos de péptidos que poseen elevada afinidad de unión a tejidos, para aislar el receptor de endostatina o las columnas de afinidad. El aislamiento y purificación del receptor de endostatina es una fase fundamental para determinar el mecanismos de acción de la endostatina. Esto facilita el desarrollo de medicamentos para madurar la actividad del receptor de endostatina, la ruta final para la actividad biológica. El aislamiento del receptor posibilita la construcción de sondas nucleótidas para controlar la localización y síntesis del receptor utilizando tecnología in situ e hibridación en solución. La endostatina es efectiva en el tratamiento de enfermedades o procesos mediados por angiogénesis o que comportan angiogénesis. La presente invención comprende el método de tratamiento de una enfermedad mediada por angiogénesis con una cantidad efectiva de endostatina o agonistas y antagonistas de endostatina. Las enfermedades mediadas por angiogénesis incluyen, sin que ello sirva de limitación, tumores sólidos; tumores originados en la sangre, tales como leucemias; metástasis tumoral; tumores benignos, por ejemplo, hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas y granulomas piogénicos; artritis reumatoide; psoriasis; enfermedades angiogénicas oculares, por ejemplo, retinopatía diabética, retinopatía de premadurez, degeneración macular, rechazo de injerto de córnea, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis; Síndrome de Osler-Webber; angiogénesis de miocardio; neovascularización de placas; telangiectasia; articulaciones hemofílicas; angiofibromas; y granulación de heridas. La endostatina es útil en el tratamiento de enfermedades de estimulación excesiva o anormal de las células endoteliales. Estas enfermedades incluyen, sin que ello sirva de limitación, adherencias intestinales, aterosclerosis, escleroderma y cicatrices hipertróficas, es decir, queloides. La endostatina puede ser utilizada como agente de control de natalidad al impedir la vascularización requerida para la implantación del blastocisto y para desarrollo de la placenta, el blastocisto, el embrión y el feto. Los fragmentos de péptido sintético de endostatina tienen una amplia variedad de utilizaciones. El péptido que se une al receptor de endostatina con alta especificidad y avidez es radioetiquetado y utilizado para visualización y cuantificación de lugares de unión, utilizando técnicas autorradiográficas y de unión de membrana. Esta aplicación proporciona importantes herramientas de diagnóstico y de investigación. El conocimiento de las propiedades de unión del receptor de endostatina facilita la investigación del mecanismo de transducción asociado al receptor. Además, el etiquetado de estos péptidos con isótopos de corto periodo de vida posibilita la visualización de lugares de unión de receptor in vivo utilizando tomografía de emisión de positrón u otras técnicas radiográficas modernas a efectos de localizar tumores con lugares de unión de endostatina. La sustitución sistemática de aminoácidos dentro de estos péptidos sintetizados da lugar a agonistas de péptidos de alta afinidad y antagonistas al receptor de endostatina que aumentan o disminuyen la unión de la endostatina a su receptor. Estos agonistas son utilizados para suprimir el crecimiento de micrometástasis, limitando de esta manera la extensión del cáncer. Los antagonistas de la endostatina son aplicados en situaciones de vascularización inadecuada para bloquear los efectos inhibitorios de la angiostatina y posiblemente promover angiogénesis. Este tratamiento puede tener efectos terapéuticos para ayudar al curado de heridas en diabéticos.

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Los péptidos de endostatina son utilizados para desarrollar columnas de afinidad para aislamiento del receptor de endostatina a partir de células tumorales cultivadas. El aislamiento y purificación del receptor de endostatina es seguido de secuenciado de aminoácidos. A continuación, se desarrollan sondas de nucleótidos para inserción en vectores 11

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para expresión del receptor. Estas técnicas son bien conocidas por los expertos en la materia. La transfección del receptor de endostatina en células tumorales aumenta la capacidad de respuesta de estas células a endostatina endógena o exógena, disminuyendo de esta manera la velocidad de crecimiento metastático. Los agentes citotóxicos, tales como ricina, están ligados a la endostatina y fragmentos de péptidos de endostatina de alta afinidad, proporcionando de esta manera una herramienta para la destrucción de células que unen la endostatina. Estas células pueden ser halladas en muchas localizaciones incluyendo, sin que ello sea limitativo, micrometástasis y tumores primarios. Los péptidos ligados a agentes citotóxicos son infundidos de una manera diseñada para hacer máximo el suministro al lugar deseado. Por ejemplo, fragmentos de endostatina de alta afinidad relacionados con ricina son facilitados a través de una cánula a vasos que alimentan el lugar objetivo o directamente al objetivo. Estos agentes son también suministrados de manera controlada a través de bombas osmóticas acopladas a cánulas de infusión. Una combinación de antagonistas de endostatina puede ser co-aplicada con estimuladores de angiogénesis para incrementar la vascularización de tejidos. Este régimen terapéutico proporciona medios efectivos de destrucción de cáncer metastático. De acuerdo con la presente invención, la endostatina puede ser utilizada en combinación con otros compuestos y procedimientos para el tratamiento de enfermedades. Por ejemplo, un tumor puede ser tratado de manera convencional por cirugía, radiación o quimioterapia combinado con endostatina y entonces la endostatina puede ser administrada subsiguientemente al paciente para extender el carácter durmiente de las micrometástasis y para estabilizar cualesquiera tumores primarios residuales. La endostatina de la presente invención puede ser también utilizada para generar anticuerpos específicos para el inhibidor. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales. Estos anticuerpos, que específicamente se unen a la endostatina, pueden ser utilizados en métodos y equipos de diagnóstico, bien conocidos por los expertos en la materia, para detectar o cuantificar la endostatina en un fluido o tejido corporal. Los resultados de estas pruebas se pueden utilizar para el diagnóstico o para predecir la existencia o recurrencia de cáncer u otras enfermedades mediadas por angiogénesis. La endostatina puede ser utilizada también en un método de diagnóstico y en un equipo de detección para cuantificar los anticuerpos capaces de unión con la endostatina. Estos equipos permitirían la detección de anticuerpos de endostatina circulantes que indican la extensión de micrometástasis en presencia de la endostatina segregada por tumores primarios in situ. Los pacientes que tienen estos anticuerpos circulantes antiendostatina, pueden tener mayores probabilidades de desarrollar tumores y cánceres, y pueden tener más probabilidades de recurrencia de cáncer después de tratamiento o periodos de remisión. Los fragmentos Fab de estos anticuerpos antiendostatina pueden ser utilizados como antígenos para generar antisueros de fragmentos Fab antiendostatina que se pueden utilizar para neutralizar la eliminación de endostatina circulante por anticuerpos antiendostatina.

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Otro aspecto de la presente invención es un método para el bloqueo de la acción de endostatina endógena en exceso. Esto se puede realizar al inmunizar pasivamente un humano o animal con anticuerpos específicos para la endostatina no deseada en el sistema. Este tratamiento puede ser importante en el tratamiento de ovulación, menstruación y placentación anormales, y vasculogénesis. Esto proporciona una herramienta útil para examinar los efectos de la eliminación de la endostatina en procesos metastáticos. El fragmento Fab de anticuerpos de endostatina contiene el lugar de unión para endostatina. Este fragmento es aislado a partir de anticuerpos de endostatina utilizando técnicas conocidas por los expertos en la materia. Los fragmentos Fab de antisueros de endostatina son utilizados como antígenos para generar la producción de suero de fragmento anti-Fab. La infusión de este antisuero contra los fragmentos Fab de endostatina impide que la endostatina se una a anticuerpos de endostatina. Las ventajas terapéuticas se obtienen al neutralizar anticuerpos endógenos antiendostatina bloqueando la unión de la endostatina a los fragmentos Fab de anti-endostatina. El efecto neto de este tratamiento consiste en facilitar la capacidad de endostatina de circulación endógena para alcanzar las células objetivo, disminuyendo de esta manera la extensión de la metástasis. Se debe comprender que la presente invención se prevé para incluir cualesquiera derivados de la endostatina que tengan actividad inhibitoria endotelial. La presente invención comprende la proteína de endostatina completa, derivados de la proteína de endostatina y fragmentos biológicamente activos de la proteína de endostatina. Éstos incluyen proteínas con actividad de endostatina que tienen substituciones de aminoácidos o que tienen azúcares u otras moléculas fijadas a grupos funcionales aminoácidos. La presente invención incluye también genes que codifican para endostatina y el receptor de endostatina, y proteínas que son expresadas por estos genes.

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Las proteínas y fragmentos de proteínas con la actividad de endostatina descrita anteriormente se pueden disponer en forma de proteínas aisladas y substancialmente purificadas y fragmentos de proteínas en formulaciones farmacéuticamente aceptables utilizando métodos de formulación conocidos por los expertos ordinarios en la materia. Estas formulaciones pueden ser administradas por rutas estándar. En general, las combinaciones se pueden administrar por vía tópica, transdérmica, intraperitoneal, intracraneal, intracerebroventricular, intracerebral, intravaginal, intrauterina, oral, rectal o parenteral (por ejemplo, intravenosa, intraespinal, subcutánea o intramuscular). Además, la endostatina puede ser incorporada en polímeros biodegradables que permiten una liberación mantenida del compuesto, implantándose los polímeros en las proximidades del lugar en que se desea el suministro del medicamento, por ejemplo, en el lugar del tumor o implantado de manera que la endostatina se libere lentamente de forma sistémica. También se pueden utilizar minibombas osmóticas para proporcionar el suministro controlado de altas concentraciones de endostatina a través de cánulas al lugar de interés, por ejemplo, directamente en un crecimiento metastásico o en el suministro vascular a dicho tumor. Los polímero biodegradables y su utilización se describen, por ejemplo, en detalle en la obra Brem y otros, J. Neurosurg. 74:441-446 (1991), que se incorpora por completo a la descripción actual como referencia. 12

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La dosificación de la endostatina de la presente invención dependerá del estado de la enfermedad que se trata y otros factores clínicos tales como peso y estado del humano o animal y la ruta de administración del compuesto. Para el tratamiento de humanos o animales, se pueden administrar aproximadamente desde 0,5 mg/kilogramo a 500 mg/kilogramo de endostatina. Una gama más preferible es de 1 mg/kilogramo a 100 mg/kilogramo, siendo la gama más preferente de 2 mg/kilogramo a 50 mg/kilogramo. Dependiendo de la vida media de la endostatina en el animal o humano específico, la endostatina puede ser administrada entre varias veces al día hasta una vez a la semana. Se comprenderá que la presente invención tiene aplicación para utilización humana y veterinaria. Los métodos de la presente invención prevén administraciones simples y múltiples, facilitadas de manera simultánea o a lo largo de un período prolongado de tiempo.

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Las formulaciones de endostatina incluyen las que son apropiadas para administración oral, rectal, oftálmica (incluyendo intravítrea o intracameral), nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), intrauterina, vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intravenosa, intradermal, intracraneal, intratraqueal y epidural). Las formulaciones de endostatina pueden ser presentadas de manera conveniente en dosis unitarias y pueden ser preparadas por técnicas farmacéuticas convencionales. Estas técnicas incluyen la etapa de llevar a establecer una asociación entre el ingrediente activo y el soporte o soportes farmacéuticos o bien excipientes. En general, las formulaciones son preparadas al asociar de manera íntima y uniforme el ingrediente activo con los portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos y, a continuación, en caso necesario, conformar el producto. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral comprenden soluciones de inyección estéril acuosa y no acuosa que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen la formulación isotónica con la sangre del receptor de destino, y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden ser presentadas en contenedores de dosis unitarias o de dosis múltiples, por ejemplo, ampollas y viales herméticos, y se pueden almacenar en situación de liofilización, requiriendo solamente la adición del portador líquido estéril, por ejemplo, agua para las inyecciones, inmediatamente antes de la utilización. Se pueden preparar soluciones de inyección extemporáneas y suspensiones a partir de polvos estériles, gránulos y tabletas del tipo anteriormente descrito. Las formulaciones de dosificación unitaria preferente son las que contienen una dosis o unidad diaria, subdosis diaria, tal como se ha indicado anteriormente, o una fracción apropiada de las mismas, del ingrediente administrado. Se debe comprender que además de los ingredientes particularmente mencionados, las formulaciones de la presente invención pueden incluir otros agentes convencionales en esta técnica con respecto al tipo de formulación en cuestión. Diferentes fragmentos de péptidos de la molécula de endostatina intacta pueden ser sintetizados para su utilización en varias aplicaciones que incluyen, sin que ello sirva de limitación, las siguientes: antígenos para el desarrollo de antisueros específicos, como agonistas y antagonistas activos en lugares de unión de endostatina, como péptidos a enlazar a agentes citotóxicos para la exterminación dirigida de células que se unen a la endostatina. Las secuencias de aminoácidos que comprenden estos péptidos son seleccionadas en base a su posición en las regiones exteriores de la molécula y son accesibles para la unión a antisueros. Los términos amino y carbóxilo de la endostatina, así como la región media de la molécula, son representados de manera separada entre los fragmentos a sintetizar. El término amino distal con respecto al aminoácido 20 y términos carbóxilo de endostatina pueden contener residuos de tirosina y lisina o se pueden modificar para que los contengan, y son marcados con muchas técnicas. Se añade una tirosina o lisina a fragmentos que no tienen estos residuos para facilitar el marcado de grupos reactivos amino e hidróxilo en el péptido. Estas secuencias de péptidos son comparadas a secuencias conocidas utilizando bancos de datos de secuencia para determinar homologías de secuencias potenciales. Esta información facilita la eliminación de secuencias que muestran un elevado grado de homología de secuencia a otras moléculas, aumentando así el potencial para alta especificidad en el desarrollo de antisueros, agonistas y antagonistas de la endostatina. Se pueden sintetizar péptidos en una instalación microquímica estándar y la pureza puede ser comprobada con HPLC y espectrofotometría de masas. Los métodos de síntesis de péptidos, purificación HPLC y espectrofotometría de masas son conocidos habitualmente por los expertos en esta materia. Los péptidos y la endostatina son producidos también en E. Coli recombinante, tal como se describe más adelante, o en sistemas de expresión de insectos o de levadura, y purificados por cromatografía de columna.

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La endostatina y los péptidos derivados de endostatina se pueden acoplar a otras moléculas utilizando métodos estándar. El término amino distal con respecto al aminoácido 20 y el término carbóxilo de endostatina pueden contener residuos de tirosina y lisina y son marcados isotópicamente y no isotópicamente por muchas técnicas, por ejemplo, radiomarcado utilizando técnicas convencionales (residuos de tirosina-clonamina T, yodógeno, lactoperoxidasa; residuos de lisina-reactivo de Bolton-Hunter). Estas técnicas de acoplamiento son bien conocidas por los técnicos en la materia. La técnica de acoplamiento es escogida en base a los grupos funcionales disponibles en los aminoácidos incluyendo, sin que sirva de limitación, amino, sulfidral, carbóxilo, amida, fenol e imidazol. Varios reactivos utilizados para conseguir estos acoplamientos incluyen entre otros, glutaraldehído, bencidina diinitrada, carbodiimida, y pbenzoquinona.

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Los péptidos de endostatina están acoplados químicamente a isótopos, encimas, proteínas portadoras, agentes citotóxicos, moléculas fluorescentes y otros compuestos para una serie de aplicaciones. La eficacia de la reacción de acoplamiento es determinada utilizando diferentes técnicas apropiadas para la reacción específica. Por ejemplo, 13

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radiomarcado de un péptido de endostatina o proteína con 125 I se consigue utilizando cloramina T y Na125 I de alta actividad específica. La reacción termina con metabisulfito sódico y la mezcla es desalada sobre columnas eliminables. El péptido marcado es eluído de la columna y se recogen fracciones. Se retiran partes alícuotas de cada fracción y se miden por radioactividad en un contador gamma. De esta manera, el Na125 I sin reaccionar es separado del péptido de endostatina marcada. Las fracciones de péptido con la radioactividad específica más elevada son almacenadas para utilización subsiguiente, tales como análisis de la capacidad de unión a antisueros de endostatina. Otra aplicación de la conjugación de péptidos es para la producción de antisueros policlonales. Por ejemplo, los péptidos de endostatina que contienen residuos de lisina son ligados a albúmina de suero bovino purificado, utilizando glutaraldehído. La eficacia de la reacción es determinada midiendo la incorporación de péptido radiomarcado. El glutaraldehído sin reaccionar y el péptido son separados por diálisis. El conjugado es almacenado para utilización subsiguiente. Se puede generar antisuero contra endostatina. Después de síntesis del péptido y su purificación se forman antisueros monoclonal y policlonal utilizando técnicas establecidas conocidas por los técnicos en la materia. Por ejemplo, se pueden formar antisueros policlonales en conejos, ovejas, cabras y otros animales. Los péptidos de endostatina conjugados a una molécula portadora tal como albúmina de suero bovino o la propia endostatina, se combinan con una mezcla coadyuvante, emulsificada e inyectada por vía subcutánea en múltiples lugares en la espalda, cuello, flancos, y algunas veces en las plantas de los pies. Se realizan inyecciones de refuerzo a intervalos regulares, por ejemplo, de 2 a 4 semanas. Se obtienen muestras de sangre por venipuntura, por ejemplo, utilizando las venas marginales de la oreja después de dilatación, aproximadamente de 7 a 10 días después de cada inyección. Las muestras de sangre son coaguladas durante una noche a 4ºC y centrifugadas aproximadamente a 2400 X g a 4ºC durante aproximadamente 30 minutos. El suero es retirado, fraccionado en partes alícuotas y almacenado a 4ºC para su utilización inmediata a una temperatura de -20 a -90ºC para análisis subsiguiente.

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Todas las muestras de suero, desde la generación de antisueros policlonales, o muestras de medios de la producción de antisueros monoclonales, son analizadas para la determinación de la concentración. La concentración o título se establece por varios métodos, por ejemplo, utilizando análisis “dot blots” y análisis de densidad, y asimismo, con precipitación de complejos de péptido radiomarcado-anticuerpo utilizando proteína A, antisueros secundarios, etanol frío o carbón activado-dextrano, seguido de medición de actividad con un contador gamma. Los antisueros de concentración más elevada son purificados también sobre columnas de afinidad que se tienen a disposición comercialmente. Los péptidos de la endostatina son acoplados al gel en la columna de afinidad. Las muestras de antisuero se hacen pasar por la columna y los anticuerpos antiendostatina permanecen unidos a la columna. Estos anticuerpos son eluídos posteriormente, recogidos y evaluados para determinación de titulación y especificidad.

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Los antisueros de endostatina de titulación más elevada son comprobados para establecer lo siguiente: a) dilución antisuero óptima para unión específica más elevada del antígeno y menor unión no específica más baja, b) capacidad de unir cantidades crecientes de péptido de endostatina en una curva de desplazamiento estándar, c) reactividad cruzada potencial con péptidos relacionados y proteínas, incluyendo especies relacionadas con endostatina, d) capacidad de detectar péptidos de endostatina en extractos de plasma, orina, tejidos y en medios de cultivo de células. También se prevén equipos para la medición de la endostatina como parte de la presente invención. Antisueros que poseen la concentración y especificidad más elevadas y que pueden detectar péptidos de endostatina en extractos de plasma, orina, tejidos y en medio de cultivo celular, son examinados adicionalemente para establecer equipos de utilización rápida para medición rápida, fiable sensible y específica, y localización de la angiostatina. Estos equipos de ensayo comprenden, sin que ello sirva de limitación, las siguientes técnicas: ensayos competitivos y no competitivos, radioinmunoensayos, bioluminiscencia y quimioluminiscencia, ensayos fluorométricos, ensayos sandwich, ensayos inmunoradiométricos, “dot blots”, ensayos de encimas ligadas incluyendo ELISA, placas de microtitulación, tiras con recubrimiento de anticuerpos o varillas para control rápido de orina o sangre, así como inmunocitoquímica. Para cada dispositivo, la gama o rango, sensibilidad, precisión, fiabilidad, especificidad y capacidad de reproducción del ensayo quedan establecidos. Las variaciones dentro del ensayo y entre ensayos se establecen en los puntos de 20%, 50% y 80% en las curvas estándar de desplazamiento o de actividad. Un ejemplo de un equipo de ensayo habitualmente utilizado en investigación y en ensayos clínicos es un equipo de radioinmunoensayo (RIA). Se muestra a continuación un RIA de endostatina. Después de la radioyodación y purificación sucesivas de endostatina o de un péptido de endostatina, el antisuero que posee la mayor concentración se añade a varias diluciones a tubos que contienen una cantidad relativamente constante de radioactividad, tal como 10.000 cpm, en un sistema tampón adecuado. Otros tubos contienen tampón o suero preinmune para determinar la unión no específica. Después de incubación a 4C durante 24 horas, la proteína A es añadida y los tubos son sometidos a torbellino, incubados a temperatura ambiente durante 90 minutos y centrifugados aproximadamente a 2000-2500 Xg a 4C para precipitar los complejos de anticuerpo unido al antígeno marcado. El sobrenadante es eliminado por aspiración y la radioactividad de las pastillas es contada en un contador de rayos gamma. La dilución antisuero que se une aproximadamente 10 a 40% del péptido marcado después de sustracción de la unión no específica se caracteriza adicionalmente.

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A continuación, una gama de dilución (aproximadamente 0,1 pg a 10ng) del péptido de endostatina utilizado para desarrollo del antisuero es evaluada por adición de cantidades conocidas del péptido a los tubos que contienen péptido radiomarcado y antisuero. Después de un periodo de incubación adicional, por ejemplo de 24 a 48 horas, se añade 14

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proteína A y los tubos son centrifugados, el sobrenadante es retirado y la radioactividad de las pastillas es objeto de contaje. El desplazamiento de la unión de péptido de endostatina radiomarcada por el péptido de endostatina sin marcar (estándar) proporciona una curva estándar. Varias concentraciones de otros fragmentos de péptido de endostatina, plasminógeno, endostatina de diferentes especies y péptidos homólogos se añaden a los tubos de ensayo para caracterizar la especificidad del antisuero de endostatina. Extractos de varios tejidos incluyendo, sin que sirva de limitación, tumores primarios y secundarios, carcinoma de pulmón de Lewis, cultivos de células que producen endostatina, placenta, útero y otros tejidos tales como cerebro, hígado e intestinos, son preparados utilizando técnicas de extracción que han sido utilizadas satisfactoriamente para extracción de endostatina. Después de liofilización o Speed Vac de los extractos de tejidos, se añade un tampón de ensayo y diferentes cantidades alícuotas se sitúan en tubos RIA. Los extractos de células conocidas que producen endostatina producen curvas de desplazamiento que son paralelas a la curva estándar, mientras que los extractos de tejidos que no producen endostatina no desplazan la endostatina radiomarcada con respecto al antisuero de endostatina. Además, se añaden extractos de orina, plasma y fluido cerebroespinal de animales con carcinoma de pulmón de Lewis a los tubos de ensayo en cantidades crecientes. Las curvas de desplazamiento paralelo indican la utilidad del ensayo de endostatina para medir la endostatina en tejidos y en fluidos corporales. Los extractos de tejidos que contienen endostatina son caracterizados adicionalmente sometiendo partes alícuotas a HPLC de fase inversa. Las fracciones eluidas son recogidas, secadas en Speed Vac, reconstituidas en tampón RIA y analizadas en el RIA de endostatina. La máxima cantidad de inmunorreactividad de endostatina es localizada en las fracciones que corresponden a la posición de elución de la endostatina. El equipo de ensayo proporciona instrucciones, antisuero, endostatina o péptido de endostatina y posiblemente endostatina radiomarcada y/o reactivos para precipitación de complejos endostatina unida-anticuerpo de endostatina. El conjunto o equipo es útil para la medición de endostatina en fluidos y tejidos biológicos extraídos de animales y humanos con y sin tumores. Otro equipo es utilizado para localización de angiostatina en tejidos y células. El equipo de inmunohistoquímica de endostatina proporciona instrucciones, antisuero de endostatina y posiblemente suero de bloqueo y antisuero secundario ligado a una molécula fluorescente tal como fluorosceína de isotiocianato o algún otro reactivo utilizado para visualizar el antisuero primario. Las técnicas de inmunohistoquímica son bien conocidas por los expertos en la materia. Este equipo de inmunohistoquímica de endostatina permite la localización de la endostatina en secciones de tejidos y en celdas de cultivo utilizando microscopio óptico y electrónico. Se utiliza tanto para la investigación como para objetivos clínicos. Por ejemplo, se efectúa la biopsia de tumores o su recogida y se cortan secciones de tejidos con un microtomo para exterminar lugares de producción de endostatina. Esta información es útil para el diagnóstico y posiblemente para objetivos terapéuticos en la detección y tratamiento de cáncer. La invención se ilustrará adicionalmente por medio de los ejemplos siguientes, que no se tienen que considerar de modo alguno como limitadores de su alcance. Por el contrario, se debe comprender claramente que se puede recurrir a otras diferentes realizaciones, modificaciones y equivalentes de los mismos que, después de la lectura de la presente descripción, pueden sugerirse a los expertos en la materia. Ejemplo 1

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Identificación de un inhibidor de proliferación de células endoteliales capilares a partir de células de hemangioendotelioma Una línea celular de hemangioendotelioma murino, EOMA (Obeso y otros, 1990), fue evaluada en cuanto a pruebas de producción de inhibidores de proliferación endotelial. Muchos de los inhibidores endógenos conocidos de angiogénesis inhiben la proliferación in vitro de células endoteliales. Recogida de medio acondicionado: Células de la línea celular EOMA de hemangioendotelioma murino fueron mantenidas en medio DMEM suplementado con 10% de suero bovino (BCS) y 1% de glutamina-penicilina-estreptomicina (GPS) en un incubador a 37ºC y 10% de CO2 . Los medios acondicionados procedentes de células EOMA (es decir, medios de cultivo utilizados para el crecimiento de células EOMA) fueron aplicados a células endoteliales capilares bovinas, estimuladas con bFGF, en un ensayo de proliferación de 72 horas. Los medios acondicionados inhibieron de manera reversible la proliferación de células endoteliales capilares en comparación con los controles. El modelo de inhibición era coherente con la presencia de actividad inhibitoria y estimuladora de la proliferación de células endoteliales (figura 1).

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Ejemplo 2 La actividad inhibitoria de la proliferación de células endoteliales no es debida a la angiostatina 65

Para determinar si el inhibidor de la proliferación de células endoteliales capilares producida por células EOMA era la angiostatina, se aplicaron medios acondicionados y acumulados a una columna de lisina (lisina conjugada con perlas de cromatografía SepharoseTM ). La Sefarosa de lisina une la angiostatina y ha sido utilizada para su purificación (O’Reilly y otros, 1996). La actividad inhibitoria de células endoteliales se observó solamente en la fracción de flujo 15

ES 2 206 602 T3 pasante y no en la fracción unida (no se muestran datos). La falta de unión de la actividad inhibitoria a sefarosa de lisina sugirió que el nuevo inhibidor de la proliferación de células endoteliales no era la angiostatina. Ejemplo 3 5

Purificación de una proteína de 20 kDa a partir de medio acondicionado de células EOMA que inhibe específicamente la proliferación celular endotelial 10

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Dado que varios inhibidores de angiogénesis tienen afinidad para la heparina, los inventores aplicaron el flujo pasante procedente de la columna de sefarosa de lisina a una columna de sefarosa de heparina. La heparina unida con actividad inhibitoria con afinidad relativamente elevada fue eluida con 0,6-0,8 M NaCl en 10 mM Tris pH 7,4, tal como se ha mostrado en la figura 2. Para purificar adicionalmente la actividad inhibitoria, la muestra fue concentrada y aplicada a filtración de gel (gel fino Bio-Rad Bio-Gel P-100 o Pharmacia Sephacryl S-200HR gel) en columna (ver figura 3), seguido de varios ciclos de HPLC de fase inversa con una columna C4. La actividad inhibitoria fue eluida a partir de la columna C4 con acetonitrilo 40-45% en 0,1% de ácido trifluoroacético, tal como se indica como ejemplo en la figura 4. Después de la columna C4 final, la actividad inhibitoria fue asociada a una proteína de masa molecular de aproximadamente 20 kDa (reducida) o 18 kDa (no reducida), por SDS-PAGE, purificada a homogeneidad aparente. Con respecto a los Ejemplos 2 y 3, se prepararon sefarosa de lisina, sefarosa de heparina, Gel Sephacryl S-200 HR (Pharmacia, Uppsala, Suecia), gel de poliacrilamida fina Bio-Gel P-100 (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA), y una columna de fase inversa C4 (SynChropak RP-4 (100 x 4,6 mm)(Synchrom, Inc., Lafayette, IN) de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes. Se equilibró una columna de heparina-sefarosa (50 x 2,5 cm) con 50 mM NaCl 10 mM Tris-HCl pH 7,4. Se aplicó medio acondicionado y acumulado y la columna fue lavada con el tampón de equilibrado. La columna fue eluida con un gradiente continuo de 50 mM-2 M NaCl en 10 mM Tris-HCl a pH 7,4 (volumen total 200 ml) seguido de 100 ml de 2 M NaCl en 10 mM Tris-HCl at pH 7,4. Se recogieron fracciones y se aplicó una parte alícuota de cada una de ellas a células endoteliales capilares. Las fracciones que inhibieron su proliferación fueron dializadas (MWCO = 6.000 - 8.000) contra PBS y concentradas utilizando un concentrador 4000 MWCO Nanospin (Gelman Sciences, Ann Arbor, MI)

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Una columna Bio-Gel P-100 o Sephacryl S-200 HR (75 x 1,5 cm) fue equilibrada con PBS. La muestra de cromatografía de heparina sefarosa fue aplicada y la columna fue llenada con tampón de equilibrio. Se recogieron fracciones y se aplicó una parte alícuota de cada una de ellas a células endoteliales. Las fracciones que inhibieron la proliferación endotelial fueron concentradas y dializadas tal como se ha indicado anteriormente.

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Una columna SynChropak RPG (100 x 4,6 mm) fue equilibrada con H2 O/0,1% ácido trifluoracético (TFA). Se utilizaron reactivos de calidad HPLC (Pierce, Rockford, IL). La muestra de cromatografía de filtrado de gel fue aplicada a la columna y la columna fue llenada con un gradiente de acetonitrilo en 0,1% TFA a 0,5 ml/minuto y se recogieron fracciones. Se evaporó una parte alícuota de cada una por centrifugación al vacío, se resuspendió en PBS, y se aplicó a células endoteliales capilares. La actividad inhibitoria fue purificada adicionalmente hasta homogeneidad aparente mediante, como mínimo, dos ciclos subsiguientes en la columna SynChropak C4.

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Para caracterizar adicionalmente el inhibidor de 20 kDa, los inventores lo probaron en varias líneas celulares de origen endotelial y no endotelial. Para el ensayo de BCE, se obtuvieron células endoteliales capilares bovinas y se cultivaron tal como se ha descrito anteriormente (Folkman y otros, 1979). Para el ensayo de proliferación, las células fueron lavadas con PBS y dispersadas en una solución al 0,05% de tripsina. Se preparó una suspensión celular (25.000 células/ml) con DMEM + 10% BCS + 1% GPS, aplicada sobre placas de cultivo gelatinizadas de 24 pocillos (0,5 mewed) y se incubaron (37ºC, 10% CO2 ) durante 24 horas. El medio fue substituido por 0,25 ml de DMEM + 5% BCS + 1% GPS y se aplicó la muestra de prueba. Después de 20 minutos de incubación, el medio y el bFGF fueron añadidos para obtener un volumen final de 0,5 ml de DMEM + 5% BCS + 1% GPS + 1 ng/ml bFGF. Después de 72 horas, las células fueron dispersadas en tripsina resuspendida en Hematall (Fisher Scientific, Pittsbu rgh, PA), y contadas en un contador Coulter. Ensayos de proliferación de células no endoteliales

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Se mantuvieron células de músculos lisos aórticos bovinos (SMC), epitelio de pigmentos retinales bovinos (RPE), epitelio de pulmón (MLE), carcinoma de pulmón de Lewis (LLC), y EOMA así como fibroblastos 3T3 en un incubador con 10% de CO2 y temperatura de 37ºC. Para los ensayos de proliferación, las células se lavaron con PBS y se dispersaron en una solución de tripsina al 0,05%. Las condiciones óptimas para los ensayos de proliferación celular se establecieron para cada tipo de células distintas. Se utilizó suero fetal de vaca (FCS) para las células RPE, MLE, y LLC y se utilizó BCS para los otros tipos de células. Una suspensión celular (20.000 células/ml para SMC, RPE, MLE; 15.000 células/ml para 3T3; 10.000 células/ml para LLC, EOMA) fue preparada con DMEM + 10% de suero bovino + 1% GPS, aplicado sobre placas de cultivo de 24 pocillos (0,5 ml/pocillo), y con incubación (37ºC, 10% CO2 ) durante 24 horas. El medio fue substituido por 0,5 ml de DMEM + 5% de suero bovino + 1% GPS y se aplicó la muestra de la prueba. Después de 72 horas, se dispersaron las células en tripsina, se resuspendieron en Hematall (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), y se contaron mediante un contador Coulter. Solamente las células endoteliales se inhibieron de manera significativa, tal como se muestra en la Tabla 2. 16

ES 2 206 602 T3 TABLA 2 Efecto de la endostatina sobre proliferación de células endoteliales y no endoteliales 5

Inhibidas Células endoteliales capilares bovinas

No inhibidas Células de músculos lisos aórticos bovinos Células epiteliales de pigmentos retinales bovinos

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Fibroblastos 3T3 Células epiteliales de pulmón de cobaya 15

Células de hemangioendotelioma EOMA Células de carinoma de pulmón de Lewis

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La inhibición fue observada en primer lugar para dosis de 100 ng/ml observando una inhibición máxima para dosis de 600 ng/ml o superiores. No se apreció inhibición significativa para células de origen no endotelial para dosis de 1 unidad logarítmica superior a las utilizadas para la inhibición de la proliferación de células endoteliales capilares (no se muestran datos). Ejemplo 4 Análisis de microsecuencia de la proteína de 20 kDa que revela identidad con un fragmento de colágeno XVIII

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El inhibidor de 20 kDa de proliferación de células endoteliales capilares del medio acondicionado fue purificado hasta homogeneidad, tal como se ha descrito en los ejemplos anteriores, resuelto por SDS-PAGE, electroaplicado (“electroblotted”) sobre PVDF (Bio-Rad, Richmond, CA), detectado mediante tinción Ponceau S, y recortado de la membrana. La secuencia N terminal fue determinada por degradación automatizada Edman sobre un secuenciador de proteínas PE/ABD Model 470A (Foster City, CA) funcionando con suministro en fase gaseosa de ácido trifluoracético. Se llevaron a cabo búsquedas de biblioteca de secuencias y alineaciones contra GenBank, Brookhaven Protein, SWISS-PROT combinados, y bases de datos PIR. Las búsquedas fueron llevadas a cabo en el National Center for Biotechnology Information a través de la utilización del servicio de red BLAST. El análisis de microsecuencia del inhibidor reveló identidad con un fragmento C terminal de colágeno XVIII. El clonado molecular y secuencia de colágeno XVIII fue descrito en primer lugar por Olsen y sus colaboradores y por Rehn y Pihlajaniemi (Oh y otros., 1994; Rehn and Pihlajaniemi, 1994). El colágeno XVIII es un nuevo colágeno que consiste en una región N terminal con 3 variantes de corte y empalme (“splice”) (Muragaki y otros., 1995; Rehn y Pihlajaniemi, 1995), una serie de dominios similares al colágeno con interrupciones y un dominio C terminal de 35 kDa no colágeno (NC1). Un análisis de microsecuencia de terminal N de 18 aminoácidos del inhibidor purificado de proliferación de células endoteliales confirma que es idéntico a un fragmento C terminal de este dominio NC1 (figura 5). Los inventores han designado este fragmento inhibitorio de colágeno XVIII “endostatina” y está incluido en el grupo de moléculas que tienen actividad de endostatina. Ejemplo 5 La endostatina de ratón recombinante (baculovirus o E. coli) inhibe la proliferación celular endotelial in vitro y la angiogénesis in vivo

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El inhibidor celular de proliferación endotelial de la presente invención puede ser expresado de forma recombinante en cualquier sistema utilizado para expresar proteínas. Ejemplos no limitadores de dichos sistemas de expresión comprenden sistemas de expresión bacteriana, sistemas de expresión de levaduras, y sistemas de expresión vírica de insectos.

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La endostatina de ratón recombinante fue expresada utilizando el sistema de expresión BacPAK baculovirus (CLONTECH Laboratories) siguiendo el protocolo del fabricante. De forma breve, un fragmento de cADN que codifica la secuencia de señal y parte terminal C (región endostatina) del colágeno de ratón XVIII fue insertado en el vector de transferencia pBacPAK8. A continuación se cotransfectaron el ADN viral (vector de expresión) BacPAK6 y el ADN plásmido del clon pBacPAK8-endostatina (vector de transferencia modificado), en las células del insecto Sf21 y se recogieron medios que contenían endostatina de ratón expresada. El BacPAK6 fue digerido en primer lugar con encima BSU36 para hacerla no competente para replicación independiente. El medio que contenía la endostatina de ratón expresada fue aplicado a una columna de Sefarosa de heparina 1,5 x 40 cm que había sido equilibrada con 50 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4. La columna fue lavada con el tampón de equilibrado y a continuación fue eluída de

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manera secuencial con 0,2M NaCl, 0,4 M NaCl, 0,6 M NaCl y 1 M NaCl en 10 mM Tris Ph 7,4. Toda la cromatografía fue llevada a cabo a 4ºC. El NaCl 0,6 M eluyente (que inhibía células endoteliales capilares bovinas en un ensayo de proliferación de 72 horas) fue dializado (6-8000 MWCO) contra PBS y a continuación reaplicado a la columna de Sefarosa de heparina. La columna fue eluída con un gradiente de 50 mM NaCl-1,2 M NaCl en 10 mM Tris pH 7,4. Se aplicó una parte alícuota de cada fracción a células endoteliales bovinas capilares, tal como se ha indicado anteriormente, y se reunieron fracciones que inhibían la proliferación, se dializaron contra PBS, y se concentraron utilizando un concentrador centrífugo Nanospin Plus (Gelman Sciences) (MWCO = 10.000). El análisis SDS-PAGE de la muestra concentrada mostró una banda discreta de Mr aparente de 20 kDa. Expresión y purificación de endostatina de ratón recombinante procedente de E. coli La parte de terminal C del cADN del colágeno XVIII fue utilizada para amplificar el cADN de endostatina de ratón que fue clonado en el vector pETKH1 (derivado de pET11d)(Studier y otros, 1990). La inducción resultó en la producción de una proteína de fusión que tenía la secuencia de aminoácido MARRASVGTD(SEQ ID NO:2)(RRAS=secuencia de reconocimiento de proteína kinasa A) y residuos de histidina 6 en el terminal N seguido de la secuencia de endostatina de ratón (pTB01#8). El plásmido pTB01#8 fue transformado en BL21:DE3 y la proteína de fusión fue purificada sobre perlas de NI+2 -NTA tal como se describe (QiaExpressionist Handbook, Qiagen). De modo breve, se cultivaron E. coli hasta un O.D.600 de 0,8 - 0,9 y se indujo la expresión de la proteína de fusión durante 3 horas con 1 mM IPTG. Las bacterias fueron agrupadas en pastillas y resuspendidas en urea 8 M, 10mM Tris-HCl pH 8,0 conteniendo 10 mM de imidazol y con incubación durante 1 hora a temperatura ambiente. La suspensión fue centrifugada durante 15 minutos a 20.000 g y el sobrenadante fue incubado con perlas de Ni+2 -NTA durante 1 hora a temperatura ambiente. La suspensión fue transferida a una columna y lavada con urea 8 M, 0,1 M Na-fosfato, 10 mM Tris-HCl pH 6,25 conteniendo 10 mM de imidazol. La proteína fue eluída con el mismo tampón, conteniendo 250 mM de imidazol. Las fracciones que contenían endostatina fueron extensamente dializadas contra PBS. Durante la diálisis, precipitó la endostatina. La endostatina precipitada fue resuspendida en PBS, la concentración de proteína fue ajustada a 2 - 4 mg/ml, y la endostatina fue almacenada a -20ºC hasta su utilización. Para los estudios con ratones, la endostatina fue suministrada a una suspensión en PBS. Para el ensayo corioalantoico de polluelo, se dializó adicionalmente la endostatina contra agua y a continuación se liofilizó.

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Se produjo endostatina de ratón recombinante en sistemas de expresión de baculovirus y E. coli. Utilizando cromatografía de Sefarosa de heparina secuencial se purificó endostatina de ratón recombinante hasta homogeneidad aparente a partir de un medio de células de insectos. Se utilizó Ni+2 -NTA-agarosa para purificar la endostatina de ratón derivada de E. coli.

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El análisis SDS-PAGE mostró una banda discreta de aproximadamente 20 kDa o aproximadamente 22 kDa (reducida) purificada a homogeneidad aparente para endostatinas recombinantes derivadas de baculovirus y E. coli, respectivamente (no se muestran datos). Se dializaron ambas contra PBS antes de utilización. Después de diálisis, el material del sistema E. coli precipitó y fue suministrado a una suspensión para estudios in vivo subsiguientes. La endostatina recombinante de baculovirus inhibió específicamente la proliferación de células endoteliales capilares bovinas de forma dependiente de la dosis. La inhibición fue observada a dosis de 100 ng/ml con inhibición máxima observada a dosis superiores a 600 ng/ml. No se observó inhibición significativa de proliferación de células de origen no endotelial o de células EOMA, cuando se comprobó la endostatina a dosis hasta 1 unidad logarítmica superior a las utilizadas para inhibir la proliferación celular endotelial.

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El material precipitado (no replegado) no era comprobable in vitro, a causa de su insolubilidad. No obstante, un pequeño porcentaje era soluble en PBS durante diálisis y esta fracción fue utilizada para los ensayos celulares endoteliales. Además, después del replegado, fue soluble e inhibió la proliferación endotelial (no se muestran datos). Cuando este material soluble fue aplicado a células endoteliales, se observó que era inhibitorio en concentraciones comparables a endostatina nativa y derivada de baculovirus.

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Para probar la capacidad de la endostatina de ratón recombinante en inhibir angiogénesis in vivo, los inventores utilizaron el ensayo de membrana corioalantoica (CAM) de polluelo (Folkman, 1985; Nguyen y otros, 1994 que se incorporan a la descripción actual a título de referencia). Se rompieron huevos Leghorn blanco fertilizados de tres días (Spafas, Norwich, CT), y se colocaron embriones con yemas intactas en platillos petri de 100 x 20 mm (Folkman, 1985). Después de 3 días de incubación (37ºC y 3% CO2 ), se aplicó un disco de metilcelulosa (Fisher Scientific, Fair Lawn, N.J.) conteniendo endostatina al CAM de embriones individuales. Los discos se prepararon por secado de endostatina en 10 µl de 0,45% metilcelulosa (en H2 O) sobre varillas de teflón. Después de 48 horas de incubación, se observaron embriones y los CAM por medio un estereomicroscopio. A dosis de 10-20 µg/10 µl, se observó una potente inhibición in vivo de angiogénesis tanto para endostatinas derivadas de E. coli como de baculovirus en la totalidad de los CAMs sometidos a prueba (n=5/grupo). El precipitado de endostatina derivado de E. coli se disolvió gradualmente a lo largo de 5 días y produjo un efecto antiangiogénico mantenido sobre las CAM implantadas. Como contraste, la endostatina soluble derivada de baculovirus se disolvió en 24 horas y proporcionó un efecto antiangiogénico máximo dentro de un periodo de 48 horas. No hubo pruebas de toxicidad en ninguno de los embriones de pollo sometidos a prueba. Se produjo endostatina humana de forma recombinante utilizando métodos similares. 18

ES 2 206 602 T3 Ejemplo 6 La endostatina de ratón recombinante inhibe el crecimiento de metástasis 5

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Dado que el crecimiento del tumor depende de angiogénesis, los inventores trataron metástasis de carcinoma de pulmón de Lewis sistemáticamente con endostatina de ratón recombinante expresada en el sistema baculovirus. Se sacrificaron animales con carcinomas de pulmón de Lewis de 600-1200 mm3 y se limpió la piel superpuesta al tumor con betadina y etanol. En una pantalla de flujo laminar se realizó la excisión de tejidos del tumor en condiciones asépticas. Se preparó una suspensión de células tumorales en 0,9% de solución salina normal por paso de tejidos de tumor viables a través de una criba y una serie de agujas hipodérmicas secuencialmente más pequeñas con medida de 22 a 30 de diámetro. La concentración final fue ajustada a 1 x 107 células/ml y la suspensión fue colocada sobre hielo. Después de limpiar el lugar con etanol, el dorso subcutáneo de ratones en la línea media próxima recibió la inyección de 1 x 106 células en 0,1 ml de solución salina. Cuando los tumores tuvieron una dimensión de 1500 mm3 , aproximadamente 14 días después del implante, los ratones fueron sometidos a la eliminación quirúrgica del tumor. La incisión fue cerrada por simples suturas interrumpidas. Desde el día de la operación, los ratones recibieron inyecciones intraperitoniales diarias de endostatina de ratón recombinante (baculovirus) o solución salina. Los ratones recibieron 0,3 mg/kg/dia de endostatina, una vez al día con inyección subcutánea. Cuando los ratones de control enfermaron de enfermedad metastásica (es decir, después de 13 días de tratamiento) todos los ratones fueron sacrificados y sometidos a autopsia. Se contaron metástasis de superficie pulmonar por medio de estereomicroscopio con 4 aumentos. El crecimiento de metástasis de carcinoma de pulmón de Lewis se suprimió casi por completo por la administración sistémica de endostatina con una dosis de 0,3 mg/kg/dia por via subcutánea (7 ± 3 metástasis/ratón, n=4, p < 0,001). Como contraste, ratones tratados con solución salina después de eliminación de un tumor primario de carcinoma de pulmón de Lewis, la metástasis de pulmón creció rápidamente (77 ± 7 metástasis/ratón). El peso del pulmón, que refleja el peso del tumor, fue de 240 ± 25 mg en los ratones tratados con endostatina con respecto a 760 ± 30 mg en los ratones de control (p < 0,001). Además, no se apreció pérdida de peso o prueba de toxicidad en ninguno de los ratones tratados con endostatina.

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Ejemplo 7 La endostatina recombinante de ratón inhibe el crecimiento de tumores primarios 35

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El rendimiento de la endostatina del sistema de baculovirus fue más bajo que el del sistema E. coli, es decir, 1-2 mg/litro con respecto 30-40 mg/litro. Por lo tanto, los inventores utilizaron endostatina derivada de E. coli para estudiar el efecto de la terapia de endostatina sobre el crecimiento de tumores primarios. Los inventores produjeron endostatina de ratón recombinante procedente de E coli en cantidad suficiente para tratar tumores primarios en carcinoma de cáncer de Lewis. La endostatina fue administrada como suspensión de la proteína purificada precipitada a ratones con carcinomas de pulmón de Lewis de como mínimo 100-200 mm3 . La proteína fue purificada por medios convencionales pero no fue replegada antes de su administración a los ratones. El precipitado inyectado fue reabsorbido lentamente a lo largo de 24-48 horas. Los inventores no conocen ningún precedente de la utilización de un depósito inyectado de proteína recombinante no replegada como método de liberación mantenida en animales. No obstante, la endostatina se reabsorbió gradualmente in vivo y demostró tener una potente actividad antiangiogénica que resultó en una actividad prolongada antitumoral y anti-angiogénica. Por lo tanto, estos datos sugieren un nuevo método general para la liberación controlada de proteínas recombinantes. Basándose en esta idea, los inventores han suministrado angiostatina recombinante no replegada a partir de E. coli con éxito similar.

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De acuerdo con ello, un aspecto de la invención consiste en la administración de endostatina recombinante o análogos de endostatina en un estado no replegado a efectos de proporcionar un depósito de liberación sostenida de proteína inhibidora de proliferación de células endoteliales a lo largo de un período mínimo de 8 horas, de manera deseable un mínimo de 12 horas, de manera más deseable como mínimo 24 horas o como mínimo 48 horas, dependiendo del paciente y de la enfermedad a tratar. La angiostatina no replegada y opcionalmente recombinante es administrada para proporcionar de manera similar, un depósito de liberación sostenida de proteína capaz de liberar proteína de angiostatina a lo largo de un período mínimo de 8 horas, de manera deseable como mínimo 12 horas, de manera más deseable como mínimo de 24 horas o como mínimo 48 horas, dependiendo del paciente y de la enfermedad a tratar. Se implantaron carcinomas de pulmón de Lewis a ratones tal como se ha descrito anteriormente. Los tumores fueron medidos con un medidor de esfera graduada (“dialcaliper”) y se determinaron los volúmenes de tumores utilizando la forma anchura2 x longitud x 0,52, y la proporción del volumen del tumor tratado con respecto al de control (T/C) fue determinada para el punto correspondiente al final del tiempo. Después de que el volumen del tumor fue de 100-200 mm3 (0,5-1% de peso corporal), lo que ocurrió dentro de un período de 3-7 días, los ratones fueron distribuidos al azar en dos grupos. Un grupo recibió endostatina de ratón recombinante (E. coli) en forma de suspensión en PBS inyectada de forma subcutánea en un lugar alejado del tumor, una vez al día. El otro grupo recibió inyecciones comparables del vehículo solamente. Los experimentos fueron terminados y los ratones sacrificados y sometidos a autopsia cuando el ratón de control empezó a morir. 19

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El crecimiento de tumores primarios de pulmón de Lewis fue suprimido de manera potente por la terapia sistémica con endostatina. Al incrementar la dosis de endostatina fue asociado a una eficacia mejorada (no se muestran datos). Para una dosis de 10 mg/kg, el crecimiento del tumor quedó inhibido en 97% en comparación con los ratones de control tratados solamente con el vehículo. Para una dosis de 20 mg/kg suministrada una vez al día en dos experimentos separados, hubo una regresión casi completa de los tumores primarios establecidos (inhibición>99%, p