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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 233 650

51 Int. Cl. : A61L 27/20

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A61L 27/38

ESPAÑA

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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 01940405 .2

86 Fecha de presentación: 03.05.2001

87 Número de publicación de la solicitud: 1280562

87 Fecha de publicación de la solicitud: 05.02.2003

54 Título: Biomateriales formados por células preadipocito para reparación de tejidos blandos.

30 Prioridad: 03.05.2000 US 201984 P

73 Titular/es: FIDIA ADVANCED BIOPOLYMERS S.R.L.

Via Ponte della Fabbrica, 3/B 35031 Abano Terme, Padova, IT Dennis von Heimburg

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

16.06.2005

72 Inventor/es: Von Heimburg, Dennis y

Pavesio, Alessandra

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Durán Moya, Carlos

ES 2 233 650 T3

16.06.2005

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 233 650 T3 DESCRIPCIÓN Biomateriales formados por células preadipocito para reparación de tejidos blandos. 5

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Resumen de la invención La presente invención está dirigida a un biomaterial para la reconstrucción de tejidos blandos, construido por un material de soporte formado por un bencil éster de ácido hialurónico y células de preadipocito inseminadas sobre dicho material de soporte, hace referencia además a un preparado inyectable para el relleno de defectos y depresiones de tejidos blandos formado por un derivado de ácido hialurónico parcialmente soluble en el preparado , y hace referencia a la utilización de dichos materiales de soporte y preparados inyectables. Antecedentes de la invención

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La corrección de defectos de tejidos blandos es un importante reto en la cirugía plástica y de reconstrucción. Los tejidos adiposos como injerto libre han sido utilizados para la reconstrucción de defectos de tejidos blandos durante más de 100 años. Sin embargo, ha existido una falta de material de implante óptimo para sustitución de tejidos blandos. Se utilizan injertos de tejidos adiposos libres, pero los resultados son pobres e impredecibles. Los trasplantes son absorbidos ampliamente y sustituidos por tejidos fibrosos y quistes de grasa. La técnica recientemente recuparada de inyección de fragmentos de grasa aspirados proporciona asimismo resultados poco satisfactorios, que varían del 50% de retracción del injerto hasta una reabsorción completa. Los malos resultados del autotrasplante de grasa libre se cree que son debidos a la baja tolerancia de las células de grasa a la isquemia y a la baja velocidad de revascularización. Las células precursoras adiposas situadas en el estroma de los tejidos adiposos pueden ser aisladas y cultivadas. Estas células demuestran diferenciación in vitro y desdiferenciación en condiciones distintas, y son una fuente posible para la ingeniería de tejidos blandos a causa de la capacidad de proliferación y de diferenciación. En un estudio preliminar, los inventores han observado que los preadipocitos se revascularizan rápidamente y reacumulan grasas después del trasplante. En un estudio reciente los preadipocitos de rata diferenciados en PLGA forman estructura (“scaffolds”) después de injerto.

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Recientemente, células de tallo de mesenquima (MSC), obtenidas de tuétano de hueso de adultos, han sido utilizadas para la producción de diferentes tipos de células de tejidos. Estas células de tallo aisladas no son totipotentes, tal como las células de tallos embriónicos, sino pluripotentes y capaces de diferenciación en tejidos conectivos y sus derivados. El mesenquima es una fuente no solamente de tejidos conectivos tales como músculos, tendones y ligamentos, sino también de sangre, cartílagos, huesos, células grasas y capas externas de los vasos sanguíneos. Hasta el momento, las células MSC han sido diferenciadas satisfactoriamente en células adiposas, células crondrocitas y células osteocitas (Pittenger y otros (1999) Science 284:143-7). Sin embargo existe todavía la necesidad de un satisfactorio agente de llenado bioartificial de tejidos blandos destinado a técnicas de tejidos, un agente de carga que idealmente podría ser un vehículo de suministro para soportar preadipocitos humanos en procesos de injerto. El material debe proporcionar una estructura para soportar las células implantadas (células preadiposas) y una estructura que permite que las células invadan y se diferencien después del trasplante. La introducción de células endoteliales, que son angiogénicas, aumentaría también el comportamiento del material de relleno de tejidos blandos de tipo bioartificial. Un número más elevado de adipocitos maduros se encuentran en tejidos adiposos bien vascularizados, posiblemente debido a la influencia que tienen las células endoteliales en los preadipocitos y adipocitos diferenciadores. Como consecuencia, las células endoteliales son particularmente útiles en la técnica de tejidos adiposos que se basa en preadipocitos. La estabilidad mecánica del soporte es también importante y el material/soporte puede no ser reabsorbido de manera demasiado rápida después del trasplante. Estas necesidades son complementadas por la presente invención, que da a conocer una matriz óptima para preadipocitos humanos aislados y cultivados, células de tallo de mesenquima y células endoteliales in vitro e in vivo. La presente invención es también útil como material de relleno bioartificial para tejidos blandos, particularmente como estructura para preadipocitos, células de tallo de mesenquima y/o células endetoliales con la capacidad de soportar adipogénesis in vivo.

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Breve descripción de las figuras

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La figura 1 muestra preadipocitos humanos 24 horas después de inseminación en una esponja HYAFF 11 (HS+). Se puede observar una buena adherencia de células viables a la estructura (“scaffold”). Se observan vacuolas citoplásmicas y éstas almacenan lípidos como signos morfológicos típicos de diferenciación. (toluidina-azul, sc= estructura).

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La figura 2 muestra un aspecto macroscópico de los injertos explantados HS después de 3 semanas en una rata desnuda. Un tejido delgado de color amarillo se presentó sobre los injertos de preadipocitos con nueva formación de vasos (derecha). La esponja de control contralateral del mismo animal no mostró prácticamente ningún cambio con respecto a la esponja y carencia de vasos (izquierda). La figura 3 muestra una vista microscópica de la sección HS+ después de 3 semanas en el ratón desnudo. Las agrupaciones diferenciadas de adipocitos son más numerosas en poros abiertos incluso en el centro de la esponja. Se 2

ES 2 233 650 T3 debe observar el manchado rojo intenso de lípido que contiene adipocitos maduros y la estructura básica. (grasa-rojo, sc= estructura). 5

La figura 4 muestra células humanas invadidas en injertos de preadipocito/estructura HS+ en el grupo A (3 semanas in vivo). Se debe observar una distribución satisfactoria y homegénea de células humanas en la estructura (“scaffold”). (mah-mancha vim, sc= estructura). La figura 5 muestra la distribución celular de células cedente y hospedante en constructos de preadipocito/estructura y controles.

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La figura 6 muestra la ultraestructura de preadipocitos en la matriz no estructurada (“nonwoven”) después de 3 semanas in vivo. Las células contienen múltiples gotitas de lípidos citoplásmicos. Las fibras y preadipocitos están íntimamente acoplados entre sí. Observar la fibra HYAFF®11 en la esquina superior izquierda y la nueva ECM intermedia. 15

La figura 7 muestra adipocitos diferenciados en una agrupación en esponja HYAFF®11 después de 8 semanas in vivo. Las células contienen gotitas de lípidos únicas de grandes tamaños (>50 µm) y muestran aspecto típico de anillo con sello. Se debe observar las nuevas fibras de colágeno intermedias en las células. 20

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Descripción detallada de la invención La corrección de defectos en los tejidos blandos por cirugía plástica o de reconstrucción se puede llevar a cabo por implantación de células precursoras adiposas aisladas y expandidas por cultivo, células MSC y/o células endoteliales. Las células precursoras adiposas, cuando son implantadas, se diferencian en adipocitos, que son células de tejidos conectivos animales especializadas en la síntesis y almacenamiento de grasas. Si bien las células MSC pueden requerir, en algunos casos, en primer lugar una manipulación in vitro para iniciar la diferenciación, estas células son también capaces de producir adipocitos. Sin embargo, se requieren soportes o estructuras apropiadas en esta técnica de tejidos blandos para permitir y favorecer la diferenciación y proliferación de las células precursoras, células MSC o células endoteliales.

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En la presente invención, el biomaterial para reconstrucción de tejidos blandos está compuesto por (a) un material de soporte formado por un bencil éster de ácido hialurónico y (b) células de preadipocitos inseminadas sobre dicho material de soporte. El material de soporte puede adoptar forma de esponja o material no estructurado (“no tejido”). Alternativamente, el biomaterial es un preparado inyectable para el relleno de defectos y depresiones de tejidos blandos formado por (a) un derivado de ácido hialurónico totalmente soluble en agua o bien un derivado de ácido hialurónico parcialmente soluble en agua, y (b) células de preadipocitos suspendidas en el preparado. Los derivados son especialmente un bencil éster o un derivado de amida. En particular, los derivados de bencil éster con 85% o menos de esterificación y la dodecilamida de HA son preferibles para preparados inyectables. El preparado de dichos bencil ésteres se describe en el documento EP 0 216 453 B1 y la preparación de derivados de amida se describe en el documento WO 00/01733. El término “ácido hialurónico” (al que se hace referencia también a continuación como “HA”) se utiliza en esta literatura para designar un polisacárido ácido con varios pesos moleculares constituidos por residuos de ácido Dglucorónico y N-acetil-D-glucosamina, que se presentan de manera natural en superficies celulares, en substancias extracelulares básicas de tejidos conectivos de vertebrados, en los fluidos sinoviales de uniones, en el humor vítreo del ojo, en el tejido del cordón umbilical humano y en crestas de pollos. El ácido hialurónico juega un papel importante en un organismo, en primer lugar como soporte mecánico de las células de muchos tejidos, tales como la piel, tendones, músculos y cartílagos y es, por lo tanto, el componente principal de la matriz intracelular. Sin embargo, el ácido hialurónico lleva a cabo también otras funciones en los procesos biológicos, tales como la hidratación de tejidos, lubrificación, migración celular, función celular y diferenciación. (Ver, por ejemplo, A. Balazs y otros, Cosmetics & Toiletries, Nº 5/84, páginas 8-17). El ácido hialurónico puede ser extraído de los tejidos naturales anteriormente mencionados, tales como crestas de gallos, o también de ciertas bacterias. En la actualidad, el ácido hialurónico puede ser preparado también por métodos microbiológicos. El peso molecular de ácido hialurónico completo obtenido por extracción se encuentra en una zona de 8-13 millones. No obstante, la cadena molecular del polisacárido se puede degradar de manera muy fácil bajo influencia de diferentes factores físicos y químicos, tales como influencias mecánicas o bajo la influencia de radiación, hidrólisis, oxidación o agentes enzimáticos. Por esta razón, frecuentemente en los procesos de purificación ordinarios o extractos originales, se obtienen fracciones degradadas con un peso molecular más bajo. (Ver Balazs y otros, antes citados). El ácido hialurónico, sus fracciones moleculares y sales correspondientes han sido utilizadas como medicamentos y su utilización se ha propuesto también en cosméticos (ver, por ejemplo, el artículo antes mencionado de Balazs y otros y la Patente francesa Nº. 2478468). Como agente terapéutico, el ácido hialurónico y sus sales han sido utilizados especialmente en terapia para artropatías, tales como en medicina veterinaria para la curación de artritis en caballos [Acta Vet. Scand. 167, 379 (1976)]. Como agente terapéutico auxiliar y de substitución para tejidos naturales y órganos naturales, se han utilizado el ácido hialurónico y sus fracciones moleculares y sus sales en cirugía oftálmica (ver, por ejemplo, Balazs y otros, Modem Problems in Ophthalmology, Vol. 10, 1970, p. 3 - E.B. Strieff, S. Karger eds., Basel; Viscosurgery and the Use of Sodium Hyaluronate During Intraocular Lens Implantation, documento presentado en el Congreso Internacional y 3

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Primer Festival de Películas sobre Implantación Intraocular, Cannes, 1979; Patente U.S.A. Nº. 4.328.803 con un resumen de la literatura sobre las utilizaciones de HY en oftalmología y en la Patente U.S.A. Nº. 4.141.973). La publicación de Patente europea Nº. 0138572 describe una fracción molecular de ácido hialurónico que puede ser utilizada, por ejemplo, como sal sódica para inyecciones intraoculares e intraarticulares adecuadas para la substitución de fluidos internos del ojo y en terapias de artropatía. El ácido hialurónico puede también ser utilizado como aditivo para una amplia variedad de materiales polímeros utilizados para artículos médicos y quirúrgicos, tales como poliuretanos, poliésteres, poliolefinas, poliamidas, polisiloxanos, polímeros vinílicos y acrílicos y fibras de carbono con el efecto de hacer estos materiales biocompatibles. En este caso la adición de HY o una de sus sales se lleva a cabo, por ejemplo, cubriendo la superficie de dichos materiales, por dispersión en el mismo o por ambos procedimientos. Estos materiales se pueden utilizar para la fabricación de diferentes artículos sanitarios y médicos, tales como válvulas cardíacas, lentes intraoculares, pinzas vasculares, marcapasos y similares (ver Patente U.S.A. Nº. 4.500.676). Si bien el término “ácido hialurónico” es utilizado habitualmente en sentido impropio, con el significado, tal como se puede apreciar de lo anterior, una serie completa de polisacáridos con alternaciones de residuos de ácido D-glucurónico y N-acetil-D-glucosamina con diferentes pesos moleculares o incluso fracciones degradadas de los mismos, y si bien la forma plural de “ácidos hialurónicos” puede parecer más apropiada, la explicación siguiente continuará utilizando la forma singular para hacer referencia al ácido hialurónico en sus diferentes formas incluyendo fracciones moleculares, y la abreviatura “HA” se utilizará también frecuentemente para describir este término colectivo. El documento EP 0 216 453 B1 describe ésteres totales o parciales de ácido hialurónico con un alcohol de serie alifática o aralifática o una sal de un éster parcial con una base orgánica o inorgánica. Estos ésteres poseen interesantes características bioplásticas y farmacéuticas y se pueden utilizar en diferentes sectores incluyendo cosmética, cirugía y medicina. En el caso del ácido hialurónico, en el que los nuevos productos poseen cualitativamente las mismas propiedades físico-químicas, farmacológicas y terapéuticas o propiedades similares, son considerablemente más estables, especialmente con referencia a la acción de las enzimas naturales responsables para la degradación de la molécula de polisacárido en el organismo, tal como especialmente hialuronidasa, y por lo tanto conservan las características anteriormente mencionadas durante períodos de tiempo muy prolongados.

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El documento WO 00/01733 describe amidas de ácido hialurónico y derivados del mismo obtenidas por reacción de grupos carboxi o grupos amino que se originan de reacciones de desacetilación con aminas y ácidos de las series alifática, aromática, arilalifática, cicloalifática, heterocíclica, y sin utilización de cadenas separadoras. Estos compuestos pueden ser o bien solubles o insolubles en agua, de acuerdo con el ácido, la amina, el porcentaje de enlace de amida o el derivado de ácido hialurónico utilizado para preparar la amida. Estas amidas pueden ser utilizadas en diferentes sectores de la cirugía, en la prevención de adhesiones post-quirúrgicas y cicatrices hipertróficas, cardiología, dermatología, oftalmología, otorrinolaringología, odontología, ortopedia, ginecología, urología, circulación y oxigenación de sangre por vía extracorpórea, cosmética y angiología. Igual que los ésteres anteriormente descritos, estas amidas de ácido hialurónico retienen la viscosidad de ácido hialurónico libre, pero son más estables y persisten durante más tiempo antes de su degradación. El documento 99/24070 describe un biomaterial que comprende un derivado de benciléster del ácido hialurónico en asociación con células tales como células tallo o adipocitos. Este biomaterial está destinado a su utilización en reconstrucción de tejidos blandos.

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El documento 97/18842 describe compuestos que comprenden un derivado de bencil éster de ácido hialurónico en asociación con células de tallo de mesenquima de tuétano de hueso a utilizar en reconstrucción de tejidos blandos tales como reconstrucción de la piel. 50

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El documento WO 98/56897 describe compuestos derivados de ácido hialurónico que comprenden células endoteliales para trasplantes de piel. En la presente invención, el éster de HA con alcohol bencílico (el bencil éster) o una amida de HA se utiliza en el soporte o estructura para células precursoras adiposas. El bencil éster de HA utilizado en la invención es preferentemente un “éster total” (es decir, un derivado en el que la totalidad de los grupos carboxilos del HA están esterificados con bencil alcohol) o un éster 5-99% (es decir, un derivado en el que de 5 a 99% de los grupos carboxilo están esterificados y los grupos restantes salificados). Estos derivados proporcionan materiales de soporte de estructura preferentes para el cultivo y crecimiento de preadipocitos humanos, células MSC y/o células endoteliales. Estos derivados pueden ser también suministrados con poblaciones acompañantes de células (preadipocitos, células tallo de mesenquima o células endoteliales) por inyección. En este caso, por ejemplo, se mezcla un bencil éster o una amida de HA con una población de preadipocitos y/o células MSC y/o células endoteliales y a continuación se inyectan en un lugar de tejidos blandos que contiene una depresión, defecto, arruga o deformidad. Los derivados de ácido hialurónico, especialmente aquéllos en los que el 85% o menos de los grupos carboxilo del HA están esterificados con bencil alcohol y la dodecil amida de HA, son especialmente preferentes. Una combinación especialmente preferente es la dodecil amida de HA y células de preadipocitos. Los bencil ésteres, tal como se ha indicado anteriormente, pueden ser preparados de acuerdo con los procedimientos en el documento EP 0 216 453 B1 (ver Ejemplos 1-4). Las amidas pueden ser preparadas de acuerdo con los 4

ES 2 233 650 T3 procedimientos descritos en el documento WO 00/01733 (ver Ejemplos 5-24). Los Ejemplos siguientes 1-24 son ejemplos de preparación que indican la forma de sintetizar derivados de ácido hialurónico utilizados en la invención. 5

Ejemplo 1 Preparación del benciléster del ácido hialurónico (HY) 10

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12,4 gramos de sal de HY de tetrabutilamonio con un peso molecular de 170.000 correspondiente a 20 m.Eq. de una unidad monómera se solubilizan en 620 ml de dimetilsulfóxido a 25º, 4,5 g (25 m.Eq.) de bromuro de bencilo y 0,2 g de yoduro de tetrabutilamonio, se añaden manteniendo la solución durante 12 horas a 30ºC. La mezcla resultante es vertida lentamente en 3.500 ml de acetato de etilo con agitación constante. Se forma un precipitado que es filtrado y lavado cuatro veces con 500 ml de acetato de etilo y finalmente es secado en vacío durante veinticuatro horas a 30º. Se obtienen 9 g del producto de bencil éster deseado. La determinación cuantitativa de los grupos éster es llevada a cabo de acuerdo con el método descrito en las páginas 169-172 de la obra de Siggia S. y Hanna J.G. “Quantitative organic analysis via functional groups” 4ª edición, John Wiley and Sons. Ejemplo 2 Preparación del bencil éster de ácido hialurónico HY

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3 g de la sal potásica de HY con un peso molecular de 162.000 son suspendidos en 200 ml de dimetilsulfóxido; se añaden 120 mg de yoduro de tetrabutilamonio y 2,4 g de bromuro de bencilo. 30

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La suspensión se mantiene en agitación durante 48 horas a 30º. La mezcla resultante es vertida lentamente en 1.000 ml de acetato de etilo con agitación constante. Se forma un precipitado que es filtrado y lavado cuatro veces con 150 ml de acetato de etilo y sometida finalmente a secado en vacío durante veinticuatro horas a 30º. Se obtienen 3,1 g del bencil éster deseado. La determinación cuantitativa de los grupos éster es llevada a cabo de acuerdo con el método descrito en las páginas 169-172 de la obra de Siggia S. y Hanna J.G. “Quantitative organic analysis via functional groups” 4ª edición, John Wiley and Sons. El material de soporte de la estructura está formado por un material esponjoso constituido por el bencil éster de HA, y se puede preparar de la manera siguiente.

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Ejemplo 3 Preparación de un material esponjoso realizado con ésteres de ácido hialurónico

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1 g de bencil ésteres de ácido hialurónico con un peso molecular de 170.000 en el que todos los grupos carboxílicos son esterificados (obtenido, por ejemplo, tal como se ha descrito anteriormente) se disuelven en 5 ml de dimetilsulfóxido. A cada fracción de 10 ml de solución preparada se añade una mezcla de 31,5 g de cloruro sódico con un grado de granularidad que corresponde a 300 µ, 1,28 g de carbonato sódico y 1 g de ácido cítrico se añaden homogeneizando el conjunto en un mezclador. La mezcla pastosa es estratificada de diferentes modos, por ejemplo, mediante un dispositivo que consiste en dos rodillos que giren en oposición entre sí a una distancia ajustable entre ambos. Regulando esta distancia, se hace pasar la pasta entre los rodillos junto con una tira de papel de silicona que actúa como soporte para la capa de pasta formada de este modo. La capa es cortada a las dimensiones deseadas de longitud y anchura, retirada de la silicona, envuelta en papel de filtro y sacada con un disolvente adecuado, tal como agua. Las esponjas obtenidas de este modo son lavadas con un disolvente adecuado, tal como agua, y opcionalmente son esterilizadas con rayos gamma. Se puede preparar un soporte de estructura formada por un material no estructurado (“no tejido”) del bencil éster de HA (conocido también como HYAFF®11), tal como se describe en la Patente U.S.A. 5.520.916 de acuerdo con los siguientes procedimientos.

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Ejemplo 4

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Se prepara una solución de HYAFF®11 en dimetilsulfóxido a una concentración de 135 mg/ml en un depósito y se suministra mediante una bomba de dosificación de engranajes a un cabezal de toberas para extrusión en húmedo compuesta de 3000 orificios, midiendo cada uno de ellos 65 micras. La masa de hilos extrusionados pasa a un baño de coagulación que contiene etanol absoluto. A continuación se desplaza sobre rodillos de transporte a dos baños de lavado sucesivo que contienen etanol absoluto. La proporción de 5

ES 2 233 650 T3 estirado del primer rodillo se dispone en un valor cero, mientras que la proporción de estirado entre los otros rodillos se dispone en 1,05. Una vez que se ha hecho pasar a través de los baños de lavado, el haz de hilos es secado por soplado con aire caliente a 45-50 grados C y es cortado con un cortador de rodillos formando fibras de 40 mm. 5

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La masa de fibras obtenida de este modo es conducida a una rampa que lleva a una máquina de carda/lapeado transversal de la que sale en forma de elemento laminar, con un grosor de 1 mm y con un peso de 40 mg/m2 . El elemento laminar es pulverizado a continuación con una solución de HYAFF®11 en dimetilsulfóxido a 80 mg/ml, colocado en un baño de coagulación de etanol en una cámara de lavado, y finalmente en una cámara de secado. El grosor total del material es de 0,5 mm. Ejemplo 5 Preparación de ácido hialurónico parcialmente N-desacetilado en forma de sal sódica (DHA/Na)

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Un gramo de hialuronato sódico, con un peso molecular medio de 600 Kda, es solubilizado en 50 ml de una solución al 1% de sulfato de hidracina en monohidrato de hidracina. Se deja reaccionar con agitación durante cinco días (120 horas) a 55ºC, después de lo cual la reacción es interrumpida por añadidura de 100 ml de etanol. El precipitado formado de esta manera es filtrado a través de un crisol Gooch, lavado con etanol y a continuación es secado a temperatura ambiente a presión reducida. Cualquier proporción de hidracida de ácido hialurónico que se pueda formar probablemente durante la reacción con hidracinolisis es destruida por reacción con HIO3 (ácido yódico). Dado que la reacción puede ser muy vigorosa, es llevada a cabo con el enfriamiento del contenedor de la reacción en agua helada. El producto de hidracinólisis es solubilizado en 50 ml de una solución de acetato sódico al 5% y se hace reaccionar con 25 ml de una solución al 0,5 M de ácido yódico. La reacción continúa durante 30 minutos con agitación, después de lo cual se añaden 5 ml de una solución al 57% de HI para destruir cualquier cantidad de HIO3 no reaccionada. El yodo que se ha formado es extraído de la solución acuosa con un mínimo de tres partes alícuotas de 30 ml de etil éter (hasta decoloración completa de la fase acuosa). La solución acuosa es llevada a pH neutro por añadidura de una solución de NaOH 0,5 M seguido de tratamiento con 100 ml de etanol. El precipitado obtenido es filtrado con un crisol Gooch, es lavado con etanol y a continuación secado a temperatura ambiente y a presión reducida. El producto obtenido se caracteriza analíticamente para determinar el porcentaje de grupos N-desacetilados y el peso molecular medio. Rendimiento de la reacción % de N-desacetilación peso molecular medio

90% 26% 130 Kda

Ejemplo 6 Preparación de la sal del ácido hialurónico parcialmente N-desacetilado con tetrabutilamonio (DHA/TBA) 40

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Un gramo (2,5 mmol.) de sal sódica de ácido hialurónico, parcialmente N-desacetilado, es solubilizado en 60 ml de agua y la solución es percolada a través de una columna llena con 25 ml de una resina sulfónica en forma de una sal de tetrabutilamonio (TBA). La resina sulfónica en forma H+ es activada con una solución al 40% peso/volumen de TBAOH. El eluido que contiene sal TBA de ácido hialurónico N-desacetilado es recogido y liofilizado. Ejemplo 7 Preparación del p-NO2 -feniléster del ácido benzoico (agente acilatante)

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Se solubilizan diez gramos (0,082 mol.) de ácido benzoico en 800 ml de CH2 Cl2 , después de lo cual se añaden 11,4 g (0,082 mol.) de p-NO2 -fenol y 16,9 g (0,082 mol.) de DCC (Diciclohexilcarbodiimida). La reacción continúa durante 2 horas, mientras que la solución es sometida a ebullición y reflujo. A continuación, la diciclohexilurea que se forma es filtrada y el producto filtrado es secado con un rotovapor a presión reducida. El producto obtenido de este modo es purificado mediante cristalización repetida en acetato de etilo. Los cristales son filtrados y colocados para su secado a temperatura ambiente a presión reducida. El derivado se caracteriza por análisis TLC (eluyente: CH2 Cl2 /acetato de etilo 90/10 y Rf=0,77) y por espectroscopia IR y UV. Rendimiento de la reacción

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92%

Ejemplo 8 Preparación de p-NO2 -feniléster de ácido cinámico (agente acilatante)

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Doce gramos (0,082 mol.) de ácido cinámico se solubilizan en 800 ml de CH2 Cl2 , después de lo cual se añaden 11,4 g (0,082 mol.) de p-NO2 -fenol y 16,9 g (0,082 mol.) de DCC (Diciclohexilcarbodiimida). La reacción prosigue durante 2 horas, mientras la solución es sometida a ebullición y reflujo. A continuación, la diciclohexilurea que se forma es filtrada y el producto filtrado es secado con un rotovapor a presión reducida. El producto obtenido de este modo es purificado por cristalización repetida en acetato de etilo. Los cristales son filtrados y colocados para su secado 6

ES 2 233 650 T3 a temperatura ambiente a presión reducida. El derivado se caracteriza por análisis TLC (eluyente: CH2 Cl2 /acetato de etilo 90/10 y Rf=0,77) y espectroscopia IR y UV. Rendimiento de la reacción

89%

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Ejemplo 9 Preparación del p-NO2 -feniléster de ácido dodecanoico (agente acilatante) 10

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Se solubilizan dieciséis gramos (0,082 mol.) de ácido dodecanoico en 1 litro de CH2 Cl2 , después de lo cual se añaden 11,4 g (0,082 mol.) de p-NO2 -fenol y 16,9 g (0,082 mol.) de DCC (Diciclohexilcarbodiimida). La reacción continúa durante 2 horas, mientras la solución es sometida a ebullición y reflujo. A continuación, la diciclohexilurea que se forma es filtrada y el producto filtrado es secado con un rotovapor a presión reducida. El producto obtenido de este modo es purificado por cristalización repetida en acetato de etilo. Los cristales son filtrados y colocados para su secado a temperatura ambiente a presión reducida. El derivado se caracteriza por análisis TLC (eluyente: CH2 Cl2 /acetato de etilo 90/10 y Rf= 0,77) y por espectroscopia IR y UV. Rendimiento de la reacción

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93%

Ejemplo 10 Preparación del p-NO2 -feniléster de ácido esteárico (agente acilatante)

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Se solubilizan 23,3 gramos de ácido esteárico en un litro de CH2 Cl2 , después de lo cual se añaden 11,4 g (0,082 mol.) de p-NO2 -fenol y 16,9 g (0,082 mol.) de DCC (Diciclohexilcarbodiimida). La reacción continúa durante 2 horas mientras la solución es sometida a ebullición y reflujo. A continuación, la diciclohexilurea que se forma es filtrada y el producto filtrado es secado con un rotovapor a presión reducida. El producto obtenido de este modo es purificado por cristalización repetida en acetato de etilo. Los cristales son filtrados y colocados para su secado a temperatura ambiente a presión reducida. El derivado se caracteriza por análisis TLC (eluyente: CH2 Cl2 /acetato de etilo 90/10 y Rf=0,77) y con espectroscopia IR y UV. Rendimiento de la reacción

87%

Ejemplo 11 35

Preparación del p-NO2 -feniléster del ácido o-acetil salicílico (agente acilatante)

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14,7 gramos de ácido acetilsalicílico son solubilizados en 1 litro de CH2 Cl2 , después de lo cual se añaden 11,4 g (0,082 mol.) de p-NO2 -fenol y 16,9 g (0,082 mol.) de DCC (Diciclohexilcarbodiimida). La reacción continúa durante 2 horas, mientras la solución es sometida a ebullición y reflujo. A continuación, la diciclohexilurea que se forma es filtrada y el producto filtrado es secado con un rotovapor a presión reducida. El producto obtenido de este modo es purificado por cristalización repetida en acetato de etilo. Los cristales son filtrados y colocados a secar a temperatura ambiente a presión reducida. El derivado se caracteriza por análisis TLC (eluyente: CH2 Cl2 /acetato de etilo 90/10 y Rf=0,77) y por espectroscopia IR y UV.

45

Rendimiento de la reacción

80%

Ejemplo 12 50

55

Preparación del ácido hialurónico parcialmente N-acetilado (con el derivado de ácido benzoico) Un gramo (1,6 mmol.) de DHA/TBA (26% de desacetilación) es solubilizado en 50 ml de DMSO, después de lo cual se añaden 5 ml de una solución al 10% de p-NO2 -feniléster de ácido benzoico (preparado según el Ejemplo 7) en DMSO. La reacción prosigue durante 24 horas con agitación a temperatura ambiente, después de lo cual se bloquea por adición de 2,5 ml de una solución saturada de NaCl. Se deja reaccionar durante 30 minutos y a continuación se añaden lentamente 100 ml de etanol. El precipitado obtenido de este modo es filtrado a través de un Gooch, lavado con etanol y etil éter y finalmente es secado a temperatura ambiente a presión reducida. El derivado es analizado por TLC (después de hidrólisis de la amida), análisis colorimétrico del porcentaje de grupos NH2 libres y espectroscopia IR y UV.

60

Rendimiento de la reacción % libre de NH2 % de N-acilación

85% 11% 15%

65

7

ES 2 233 650 T3 Ejemplo 13 Preparación de ácido hialurónico parcialmente N-acetilado (con el derivado de ácido cinámico) 5

10

15

Un gramo (1,6 mmol.) de DHA/TBA (26% de desacetilación) es solubilizado en 50 ml de DMSO, después de lo cual se añaden 5 ml de una solución al 10% de p-NO2 -feniléster de ácido cinámico (preparado según el Ejemplo 8) en DMSO. La reacción prosigue durante 24 horas, con agitación a temperatura ambiente, después de lo cual es bloqueada añadiendo 2,5 ml de una solución saturada de NaCl. Se deja reaccionar durante 30 minutos y a continuación se añaden lentamente 100 ml de etanol. El precipitado obtenido de este modo es filtrado a través de un Gooch, lavado con etanol/agua 9:1, éter etílico y finalmente es secado a temperatura ambiente a presión reducida. El derivado es analizado por TLC (después de hidrólisis de la amida), análisis colorimétrico del porcentaje de grupos libres de NH2 y espectroscopia IR y UV. Rendimiento de la reacción % libre de NH2 % de N-acilación

85% 11% 15%

Ejemplo 14 20

25

30

35

Preparación de ácido hialurónico parcialmente N-acetilado (con el derivado de ácido dodecanoico) Un gramo (1,6 mmol.) de DHA/TBA (26% de desacetilación) es solubilizado en 50 ml de NMP, después de lo cual se añaden 5 ml de una solución al 10% del p-NO2 -feniléster de ácido dodecanoico (preparado de acuerdo con el Ejemplo 9) en NMP. La reacción continúa durante 24 horas, con agitación a temperatura ambiente, después de lo cual es bloqueada por adición de 2,5 ml de una solución saturada de NaCl. Ésta se deja reaccionar durante 30 minutos y a continuación se añaden lentamente 100 ml de etanol. El precipitado obtenido de este modo es filtrado a través de un Gooch, lavado con etanol y éter etílico y secado finalmente a temperatura ambiente y a presión reducida. El derivado es analizado por TLC (después de hidrólisis de la amida), análisis colorimétrico del porcentaje de grupos NH2 libres y espectroscopia IR y UV. Rendimiento de la reacción % libre de NH2 % de N-acilación

88% 10% 16%

Ejemplo 15 Preparación de ácido hialurónico parcialmente N-acetilado (con el derivado de ácido esteárico) 40

45

50

55

Un gramo (1,6 mmol.) de DHA/TBA (26% de desacetilación) se solubiliza en 50 ml de NMP, después de lo cual se añaden 5 ml de una solución al 10% de p-NO2 -feniléster de ácido esteárico (preparado según el Ejemplo 10) en NMP. La reacción continúa durante 24 horas, bajo agitación a temperatura ambiente, después de lo cual es bloqueada por adición de 2,5 ml de una solución saturada de NaCl. Se deja reaccionar durante 30 minutos y a continuación se añaden lentamente 100 ml de etanol. El precipitado obtenido de este modo es filtrado a través de un Gooch, lavado con etanol y éter etílico y finalmente es secado a temperatura ambiente y presión reducida. El derivado es analizado por TLC (después de hidrólisis de la amida), análisis colorimétrico del porcentaje de grupos NH2 libres y espectroscopia IR y UV. Rendimiento de la reacción % libre de NH2 % de N-acilación

85% 12% 14%

Ejemplo 16 Preparación de ácido hialurónico parcialmente N-acetilado (con el derivado de ácido acetil salicílico)

60

65

Un gramo (1,6 mmol.) de DHA/TBA (26% de desacetilación) es solubilizado en 50 ml de NMP, después de lo cual se añaden 5 ml de una solución al 10% del p-NO2 -feniléster de ácido acetil salicílico (preparado según el Ejemplo 11) en NMP. La reacción continúa durante 24 horas, con agitación a temperatura ambiente, después de lo cual se bloquea por adición de 2,5 ml de una solución saturada de NaCl. Se deja reaccionar durante 30 minutos y a continuación se añaden lentamente 100 ml de etanol. El precipitado obtenido de este modo es filtrado a través de un Gooch, lavado con etanol y etil éter y finalmente secado a temperatura ambiente y a presión reducida. El derivado es analizado por TLC (después de hidrólisis de la amida), análisis colorimétrico del porcentaje de grupos NH2 libres y espectroscopia IR y UV.

8

ES 2 233 650 T3 Rendimiento de la reacción % libre de NH2 % de N-acilación 5

90% 10% 16%

Ejemplo 17 Preparación de la bencilamida del ácido hialurónico

10

15

Dos gramos (3,2 mmol.) de sal de tetrabutilamonio de ácido hialurónico (HA/TBA) se solubilizan en 100 ml de DMSO. Esta solución es suplementada con 3 ml de resina ácido húmeda en DMSO y 784 mg (4,8 mmol.) de 1,1carbonildiimidazol. Se deja reaccionar con agitación durante 12 horas, después de lo cual se filtra a través de un crisol Gooch para eliminar la resina y el producto filtrado es suplementado con 1 ml (9,6 mmol) de bencilamina. Se deja reaccionar durante 48 horas y a continuación se añaden 5 ml de una solución saturada de NaCl y se deja en agitación durante 30 minutos. Se suplementa con 200 ml de acetona y el precipitado obtenido de esta manera es filtrado y secado a presión reducida. El derivado seco es analizado por TLC, IR y HPLC. % de amidación

20

25%

Ejemplo 18 Preparación de la bencilamida del ácido hialurónico

25

30

Dos gramos (3,2 mmol.) de sal de tetrabutilamonio del ácido hialurónico (HA/TBA) se solubilizan en 100 ml de DMSO. La solución se ajusta a pH 3 con HCl 1 M y a continuación con 784 mg (4,8 mmol) de 1,1-carbonildiimidazol. Se deja reaccionar con agitación durante 12 horas, después de lo cual se filtra a través de un crisol Gooch para eliminar la resina y el producto filtrado es suplementado con 1 ml (9,6 mmol) de bencilamina. Se deja reaccionar durante 48 horas y a continuación se añaden 5 ml de solución saturada de NaCl y se deja en agitación durante 30 minutos. Se suplementa con 200 ml de acetona y el precipitado obtenido de este modo es filtrado y secado a presión reducida. El derivado seco es analizado por TLC, IR y HPLC. % de amidación

15%

Ejemplo 19 35

40

Preparación de la bencilamida de ácido hialurónico Se solubilizan dos gramos (3,2 mmol.) de ácido hialurónico en forma ácida en 100 ml de DMF. A esta solución se añaden 854 mg (5,2 mmol.) de 1,1-carbonildiimidazol. Se deja reaccionar con agitación durante 6 horas, después de lo cual se añaden 1,13 ml (10,4 mmol) de bencilamina. La reacción prosigue durante 48 horas y a continuación es bloqueada por añadidura de 200 ml de acetona. El precipitado obtenido es filtrado y secado a presión reducida. El derivado seco se caracteriza por TLC, IR y HPLC. % de amidación

45

60%

Ejemplo 20 Preparación de la bencilamida de ácido hialurónico

50

55

Dos gramos (3,2 mmol.) de ácido hialurónico en forma ácida son solubilizados en 100 ml de DMF. A esta solución se añaden 2 ml de piridina, 3,68 g (0,025 mmol.) de p-NO2 -fenol y cloruro de piridina hasta alcanzar pH 7/8. Finalmente, se añaden 5,3 (0,026 mol.)de DCC y 2,8 (0,026 mol.) de benzilamina. Se deja reaccionar con agitación durante 16 horas, después de lo cual se bloquea con añadidura de 200 ml de acetona. El precipitado obtenido es filtrado y secado a presión reducida. El derivado seco se caracteriza por TLC, IR y HPLC. % de amidación

5%

Ejemplo 21 60

65

Preparación de la bencilamida de ácido hialurónico Dos gramos (3,2 mmol.) de HA/TBA son solubilizados en 100 ml de DMSO. La solución es insuflada con HCl gaseoso hasta que la mezcla de reacción alcanza un pH comprendido entre 4,5 y 5. A continuación, se añaden 518 mg (3,2 mmol.) de carbonildiimidazol. Se deja reaccionar con agitación durante una hora, después de lo cual se añaden 0,700 ml (6,4 mmol.) de bencilamina. La reacción prosigue durante 16-18 horas. Después de este tiempo, se añaden 5 ml de una solución saturada de NaCl. Se precipita añadiendo 200 ml de acetona y el precipitado obtenido de este modo es filtrado y secado a presión reducida. El derivado seco es analizado por TLC, IR y HPLC.

9

ES 2 233 650 T3 % de amidación

50%

Ejemplo 22 5

10

Preparación de la octilamida de ácido hialurónico Se solubilizan dos gramos (3,2 mmol.) de HA/TBA en 100 ml de DMSO. La solución es insuflada con HCl gaseoso hasta que la mezcla de reacción alcanza un pH entre 4,5 y 5. A continuación, se añaden 207 mg (1,28 mmol.) de carbonildiimidazol. Se deja reaccionar con agitación durante una hora, después de lo cual se añaden 0,417 ml (3,2 mmol.) de octilamina. La reacción prosigue durante 16-18 horas. Después de este período de tiempo, se añaden 5 ml de una solución saturada de NaCl. Se precipita por añadidura de 200 ml de acetona y el precipitado obtenido de este modo es filtrado y secado a presión reducida. El derivado seco se analiza por TLC, IR y HPLC. % de amidación

25%

15

Ejemplo 23 Preparación de dodecilamida de ácido hialurónico 20

25

Dos gramos (3,2 mmol.) de HA/TBA son solubilizados en 100 ml de DMSO. La solución es insuflada con HCl gaseoso hasta que la mezcla de reacción alcanza un pH comprendido entre 4,5 y 5. A continuación se añaden 104 mg (0,64 mmol.) de carbonildiimidazol. Se deja reaccionar bajo agitación durante una hora, después de lo cual se añaden 600 mg (3,2 mmol.) de dodecilamina. La reacción prosigue durante 16-18 horas. Después de este período de tiempo, se añaden 5 ml de una solución saturada de NaCl. Se precipita por añadidura de 200 ml de acetona y el precipitado obtenido de este modo es filtrado y secado a presión reducida. El derivado seco es analizado por TLC, IR y HPLC. % de amidación

15%

Ejemplo 24 30

Preparación de hexadecilamida de ácido hialurónico

35

Dos gramos (3,2 mmol.) de HA/TBA son solubilizados en 100 ml de DMSO. La solución es insuflada con HCl gaseoso hasta que la mezcla de reacción alcanza un pH comprendido entre 4,5 y 5. A continuación se añaden 52 mg (0,32 mmol.) de carbonildiimidazol. Se deja reaccionar a temperatura ambiente con agitación durante una hora, después de lo cual se añaden 780 mg (3,2 mmol.) de hexadecilamina. La reacción prosigue durante 16-18 horas. Después de este período de tiempo, se añaden 5 ml de una solución saturada de NaCl. Se precipita por añadidura de 200 ml de acetona y el precipitado obtenido de este modo es filtrado y secado a presión reducida. El derivado seco es analizado por TLC, IR y HPLC.

40

% de amidación

5%

Evaluación de las características biológicas 45

50

55

60

65

En este estudio se aislaron preadipocitos humanos y se cultivaron. Se inseminaron 106 preadipocitos en diferentes estructuras (“scaffolds”) y se implantaron en 42 ratones para comprobar los nuevos materiales. Se utilizaron esponjas y materiales no tejidos basados en ácido hialurónico modificado por esterificación (HYAFF®11)y esponjas de colágeno. Estructuras sin células sirvieron como controles negativos en el mismo animal. Después de 3 y 8 semanas se explantaron los injertos. Se evaluaron el aspecto macroscópico, peso, grosor, características microscópicas, inmunohistoquímica y TEM (estructura básica, celularidad, profundidad de penetración de las células inseminadas, vascularización) en cuanto a diferencias en las interacciones de estructura-célula. Resultados: In vitro los preadipocitos se diferenciaron más rápidamente cuando estaban acoplados a HYAFF®11 estructuras (“scaffolds”). Macroscópicamente todos los constructos de preadipocitos tenían aspecto amarillento y presentaban numerosos vasos, apareciendo los controles de color blanco y avasculares. Microscópicamente los constructos HYAFF®11 mostraron densidades de células superiores que los constructos de colágeno. Los poros de las esponjas contenían más adipocitos diferenciados que los no tejidos, mientras que los preadipocitos no diferenciados fueron más numerosos en el no tejido. La penetración de células precursoras adiposas era más profunda y más homogénea en estructuras HYAFF®11. Todos los injertos de preadipocitos tenían mejor vascularización que los controles; la formación de los vasos era más pronunciada alrededor de los adipocitos maduros. La microscopia electrónica demostró adipocitos bien diferenciados y grandes cantidades de ECM alrededor de los preadipocitos en esponjas de HYAFF®11. Conclusión: Los preadipocitos humanos cultivados in vitro se diferencian en tejidos similares a los adiposos. Este prometedor método se utilizará para futura reconstrucción de defectos en tejidos blandos. Las esponjas de HYAFF®11 soportaron la expansión y diferenciación de las células precursoras adiposas. Este portador es superior al no tejido con respecto a la diferenciación de adipocitos y superior a la esponja de colágeno con respecto a la celularidad.

10

ES 2 233 650 T3 Materiales y métodos Estructuras (“Scaffolds”) 5

10

15

20

Esponjas de colágeno (CS) Se produjeron estructuras de esponjas de colágeno por un método de solidificación direccional descrito por Heschal y otros, Posibles aplicaciones de técnicas de solidificación direccional en criobiología. En P. Kittel (Ed.) Advances of Cryogenic Engineering. Vol. 41, Nueva York: Plenum Press, 1996. Se congeló y se liofilizó a continuación colágeno bovino tipo I (1,8% en peso) en suspensión (Dr. Otto Suwelack GmbH, Alemania), ver WO 99/27315. Los poros restantes corresponden a la estructura cristalina de hielo anterior con un tamaño promedio de poros de 50 µm, tal como se describe por Schoof y otros, EinfluB des Einfriervorganges auf die Porenstruktur gefriergetrockneter Kollagenschwämme. Ki-Luft und Källetechnik 34, 1998. Esponjas de HYAFF® (HS) Se prepararon esponjas de HYAFF®11 (derivado lineal de ácido hialurónico modificado por esterificación completa de la función carboxílica del ácido glucurónico con grupos bencilo) tal como se ha descrito anteriormente y por Rastrelli y otros, Hyaluronic acid esters, a new class of semisynthetic biopolymers: chemical and physico-chemical properties. Clin. Implant. Mater. 9: 199, 1990. La estructura HS tiene poros de interconexión abiertos obtenidos por una tecnología con proceso de inversión de fase acoplada con un proceso de gas a baja presión. Los tamaños de poros varían entre 50 y 340 µm. HYAFF®11 no tejido (HV)

25

El HV se compone de fibras no tejidas (espesor 20 µm) de hialuronan bencil éster con un peso específico de 100 g/m2 que se preparó también tal como se ha descrito anteriormente. Para los experimentos todos los materiales esterilizados fueron cortados en muestras (0,75 cm x 0,75 cm x 0,5 cm).

30

Cultivos celulares y biohíbridos in vitro

35

40

45

50

55

60

Se aislaron preadipocitos procedentes de tejidos adiposos subcutáneos humanos recién cortados (0,4-0,7 gramos) de adultos jóvenes (edad: 18-29 años) en el Departamento de Cirugía Plástica de Cirugía de Manos - Centro de Quemados que llevó a cabo las operaciones electivas (por ejemplo, reducción de mamaplastia). Los tejidos fibrosos fueron retirados, los tejidos adiposos fueron triturados en trozos y sometidos a digestión por colagenasa 0,1 U ml−1 /dispasa 0,8 U ml−1 (Boehringer Mannheim, Alemania) en un baño de agua a 37ºC durante 60 minutos con agitación permanente. La digestión fue interrumpida por adición de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) conteniendo 15% FCS (Biochrom, Berlin, Alemania) e incubado en tampón de lisis de eritrocitos (154 mmol l−1 NH4 Cl, 10 mmol l−1 KHCO3 , 1 mmol l−1 EDTA, 10 minutos). La suspensión de células fue centrifugada (200xg a 17ºC durante 10 minutos) y las células fueron inseminadas sobre platillos de cultivo de tejidos (63,6 cm2 , Greiner, Solingen, Alemania) con DMEM 15 FCS (con añadidura de 100 U ml−1 penicilina, 100 µg ml−1 Streptomicina) con una densidad de inseminación de 3x104 células/cm2 . Las células fueron sometidas a cultivo a 37ºC a 10% CO2 , el medio fue cambiado en el día 2 y suplementado con EGF (factor de crecimiento epidérmico, 10 ng ml−1 , Sigma). Se tripsinizaron preadipocitos del segundo paso en la confluencia, se resuspendieron y contaron en un hemocitómetro. Se sembró una suspensión de 100 µl conteniendo 1 x 106 ± 5 x 104 células (acumulaciones de preadipocitos) sobre la superficie superior al verter suavemente sobre el FCS humedecido (el humedecimiento de FCS de las estructuras duró 24 horas a 37ºC antes de la inseminación de las células) y se dejó en el incubador durante 24 horas para permitir el acoplamiento de las células. Modelo experimental in vivo Ratones atímicos desnudos (8 semanas, NMRI nu/nu) fueron operados en condiciones asépticas y con inhalación de anestesia (Enflurane®). Se transplantaron 42 constructos fabricados de preadipocito/estructura (+) y 42 controles negativos (-) (estructura sin células, empapado con DMEM durante 24 horas). Cada uno de los animales recibió un constructo de preadipocito/estructura subcutáneamente para dejar el área escapular y su control correspondiente en el lado contralateral mediante incisiones separadas. La parte baja de los constructos fue colocada sobre los haces musculares. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la ley alemana de Protección de Animales. Después de 3 semanas (grupo A, 21 animales llevando 7CS+ y 7CS-, 7 HS+ y 7 HS-, 7 HV+ y 7 HV-) y 8 semanas (grupo B, 21 animales 7CS+ y 7 CS-, 7 HS+ y 7 HS-, 7 HV+ y 7 HV-) los ratones fueron sacrificados por sobredosis de anestésico gaseoso. Las muestras fueron retiradas para análisis macroscópico (color, vasos, crecimientos internos) y microscópico. El peso de cada una de las esponjas fue evaluado antes del transplante y después de la explantación. Histología e Inmunohistoquímica

65

Una parte de las muestras cortadas verticalmente fue fijada en solución de formaldehido con tampón al 4% y embebido posteriormente en parafina, siendo criofijada la otra mitad. Ambas fueron seccionadas verticalmente. Se obtuvieron imágenes ultraestructurales a partir de muestras in vitro (3 muestras) e in vivo (6 muestras). Se prepara11

ES 2 233 650 T3

5

ron cortes de tejido de 6 µm (muestras de parafina) y se tiñeron con hematoxilin-eosina y Giemsa. Los fragmentos criofijados fueron teñidos con aceite rojo para identificación de vacuolas de lípidos. Se tiñeron las secciones de parafina de las matrices inseminadas y de los controles no inseminados mediante anticuerpos monoclonales específicos para vimentina humana (mahv, clon V9, Código Nr. M 0725 Lote 057, DAKO, Dinamarca) con dilución de 1:10. Tres examinadores, que no sabían a qué grupo pertenecían las secciones, evaluaron independientemente las secciones histológicas. Cuando se observaron diferencias entre ambas evaluaciones, se calculó el valor medio. Se evaluó la celularidad no específica (donante y hospedante) contando todos los núcleos de células manchadas con Giemsa en 5 campos microscópicos definidos de las secciones transversales con 200 aumentos.

10

Se evaluó la celularidad específica (donante = humano) al contar todas las células positivas de vimentina humana en 5 campos microscópicos definidos con 200 aumentos. 15

Se midió la profundidad de penetración de las células donantes en tres campos microscópicos definidos con 200 aumentos utilizando un micrómetro intraocular (Zeiss). Se evaluó la vascularización de los injertos en las secciones transversales. En caso de no existir vasos se indicó “-”, los vasos en una o varias regiones superficiales se designaron “+”, los vasos en la zona central “++” y una distribución homogénea de vasos en el injerto recibió la designación “+++”.

20

La ultraestructura de los injertos fue evaluada después del proceso de posfijación y se observó con un microscopio electrónico Philips EM 400. Evaluación estadística 25

30

Se expresaron los datos de peso y grosor de los injertos, la celularidad global de los injertos y la profundidad de penetración de los preadipocitos humanos inseminados en forma de valor medio y desviación ± estándar. La significación de diferencias entre diferentes períodos de implantación y entre los constructos de preadipocitos/estructura y los controles negativos se evaluó por prueba de rango de Wilcoxon. Las diferencias a p < 0,05 se consideraron significativas. Resultados Cultivo

35

Las células se adhirieron a las estructuras 24 horas después de inseminación (figura 1). La penetración de las células in vitro se observó solamente en las áreas superficiales de la estructura. Inmediatamente después del transplante, los precursores adiposos HS+ y HV+ mostraron algunas vacuolas citoplásmicas y forma redonda y signos de diferenciación (figura 1) en histología y en ultraestructura. Esto no se observó en muestras CS+. 40

Morfología general

45

50

Todos las muestras fueron identificadas fácilmente. La forma global de las muestras CS+ y HS+ casi no cambió después de 3 y 8 semanas. Las muestras CS- y HS- mostraron bordes redondos y tenían un aspecto más pequeño que las CS+ y HS+. Las HV+ mostraron gran variación entre las muestras, las esctructuras HV- mostraron la deformación y retracción mayores. Todos los constructos de preadipocito/estructura fueron cubiertos por capas muy adherentes de tejido amarillo macroscópicamente y nuevos vasos en la parte superior (figura 2). Los injertos de control tenían un aspecto blanco y casi avascular (figura 2). Cambio de peso como función del tiempo (Tabla 1)

55

Pesos CS+ y CS-: después de 24 horas in vitro no hubo diferencia en peso entre las estructuras de colágeno que llevaban preadipocitos CS+ y los que no tenían células CS-. Después de tres semanas in vivo había una pérdida significativa de peso para CS+ y CS-. CS+ presentaba un peso significativamente superior a CS-. La reducción de peso entre 3 y 8 semanas fue inferior que la reducción de peso entre la implantación y la semana 3.

60

Pesos HS+ y HS-: después de 24 horas in vitro el peso de constructos de preadipocito/estructura HS+ fue superior que los controles HS-. Después de 3 semanas en el ratón desnudo se produjo un incremento de peso en HS+ mientas que hubo una reducción de peso en el control HS-. La diferencia era significativa. Después de 8 semanas HS+ tenía todavía un peso significativamente superior al de los controles. Pesos HV+ y HV-: la matriz no tejida con preadipocitos mostró pesos superiores que los controles en todo momento. Se apreció después de 8 semanas in vivo una ligera ganancia de peso con una notable variación en HV+.

65

Comparando las tres estructuras (CS, HS y HV) entre sí, la estructura HV mostró el peso más bajo de las estructuras diseminadas y la variación más grande entre las muestras. Los injertos con preadipocitos tenían peso más elevado en todos los injertos en todo momento, siendo ello significativo para HS+ y HV+. Solamente se observó una ganancia 12

ES 2 233 650 T3 significativa de peso en preadipocitos que llevaban HS+ que correspondían a los tejidos parecidos a adiposos que se desarrollaron en esta estructura. Cronología histomorfológica de los injertos 5

Generalidades

10

15

Cada una de las muestras explantadas fue rodeada por una cápsula fibrosa delgada, que separaba la estructura con los nuevos tejidos formados parecidos a adiposos con respecto a los tejidos hospedantes circundantes. El examen microscópico de los constructos de preadipocitos/estructura demostraron tejidos adiposos viables situados sobre las superficies de las estructuras bajo la cápsula. Se encontraron adipocitos maduros en las áreas por debajo de la superficie. No se observaron adipocitos diferenciados en la región central de las esponjas. Muchos vasos presentaron en esta nueva forma tejidos adiposos. En los injertos de control no se encontraron en absoluto adipocitos. Los poros parecían haberse colapsado en HV (fibras hinchadas y poros estrechos) y en CS (áreas de infraestructura y poros obstruidos). Solamente en HS se mantenía bien la estructura porosa. En estas áreas HS+ el tejido adiposo estaba compuesto por agrupaciones de adipocitos (figura 3). Celularidad

20

25

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35

La celularidad no específica (donante y hospedante) en muestras de colágeno era superior en los injertos CS+ que en los injertos CS- después de 3 y 8 semanas mientras que hubo una reducción en la celularidad no específica en CS+ y CS- (Tabla 2). En las muestras HYAFF 11 había una celularidad no específica más elevada en los injertos de control (HS- y HV-) que en las muestras que llevaban preadipocitos(HS+ y HV+). Ente la semana 3 y la semana 8 hubo una reducción ligera de la celularidad no específica en HS+, HV+ y HV- (Tabla 2). El manchado para vimentina humana indicó que las células en las muestras CS+, HS+ y HV+ eran fuertemente positivas demostrando origen humano (Figura 4). No hubo manchado positivo en las muestras CS-, HS- y HV-. Esta celularidad específica (donante) mostró interesantes resultados en las tres estructuras distintas (Tabla 2). En HS+ no hubo diferencia entre la semana 3 y la semana 8; la celularidad no específica era superior que la celularidad específica. En CS+ hubo una reducción ligera entre la semana 3 y la semana 8. En HV+ hubieron diferencias significativas entre la semana 3 y la semana 8. La celularidad específica más elevada de todas las estructuras se observó en HV+ en la semana 3 (115 células/campo) pero 8 semanas después de la implantación el número de células humanas se redujo en HV+ al número más bajo de todas las estructuras (26 células/campo). Profundidad de penetración

40

La profundidad de penetración de las células precursoras adiposas humanas después de 3 semanas in vivo era diferente para cada uno de los materiales (Tabla 3, figura 5). La mejor penetración se encontró en HS+. Después de 3 semanas la mayor parte de muestras HS+ presentaba penetración completa de las células, después de 8 semanas en todas las HS+ la penetración era completa. La profundidad de penetración era ¾ del grosor de la estructura en HV+ después de tres semanas y completa en HV+ después de 8 semanas. En CS+ había una penetración parcial después de tres semanas con profundidad creciente, pero todavía parcial después de 8 semanas.

45

Solamente se encontraron adipocitos maduros en algunas áreas. El número más elevado de adipocitos maduros penetraron 1800 µm en HS+ (figura 3), el número mínimo de adipocitos maduros penetró solamente 280 µm en HV+ (Tabla 3, Figura 5). No se encontraron adipocitos en ninguno de los injertos de control. 50

Neovascularización

55

Hubo una formación de nuevos vasos notablemente mejor en los constructos de preadipocito/estructura (+ Media) en comparación con los controles negativos (- Media) para todos los materiales (Tabla 4). En los poros de interconexión abiertos de HS la neovascularización era mejor (++). En ninguno de los injertos explantados la distribución era homogénea y rica en vasos (+++). Ultraestructura de los injertos

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La microscopia electrónica detalló células precursoras adiposas humanas y su interacción con las estructuras. Después de 3 semanas in vivo se encontraron numerosas gotitas de lípido citoplásmico en todos los preadipocitos. En HV+ se encontraron principalmente preadipocitos tipo bastón con múltiples pequeñas gotitas de lípidos (figura 6) indicando que no había diferenciación completa. Se presentaron precursores parecidos a fibroblastos no diferenciados profundamente dentro de la parte no estructurada (nonwoven) (HV+) en poros estrechos íntimamente asociados al material portador. En HV- se encontraron muchas más células después de 3 semanas que en los constructos de preadipocito/estructura básica. Se presentaron muchos histiocitos y células gigantes en el control negativo de injertos HV-. En HS+ se encontraron principalmente células de forma redonda con gotitas de lípido únicas grandes con aspecto de anillo de sello típico de adipocito (figura 7). Se presentaron numerosos capilares situados cerca de los preadipocitos y adipocitos. Se encontraron nuevos fibrilos de colágeno en proximidad íntima a la estructura. Los adipocitos se encon13

ES 2 233 650 T3 traron fijados íntimamente a la estructura y se encontraron haces de nuevos fibrilos de colágeno intermedios (figura 7). Después de 8 semanas la morfología in vivo de los adipocitos fue similar a las muestras de 3 semanas. Las estructuras mostraron una forma más irregular y poros obstruidos por residuos colapsados de la estructura base. Hubieron algunas células gigantes y nuevas células ECM formadas compuestas principalmente por fibras de colágeno. 5

TABLA 1

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Pesos medios de las diferentes estructuras in vitro (24 horas) y después de ser implantadas en ratones desnudos con preadipocitos humanos (+) y sin preadipocitos humanos fijados (-). CS (esponjas de colágeno), HS (esponjas de HYAFF®11) y HV (HYAFF®11 sin tejer)

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*Después de 3 semanas in vivo se presentó una pérdida de peso significativa (p