19

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 231 279

51 Int. Cl. : C07D 401/06

7

A61K 31/445 A61P 5/00

ESPAÑA

12

TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 00974349 .3

86 Fecha de presentación: 10.11.2000

87 Número de publicación de la solicitud: 1230236

87 Fecha de publicación de la solicitud: 14.08.2002

54 Título: Compuesto con propiedades de liberación de la hormona del crecimiento.

30 Prioridad: 10.11.1999 DK 161899

73 Titular/es: NOVO NORDISK AS.

Novo Alle 2880 Bagsvaerd, DK

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

72 Inventor/es: Ankersen, Michael

16.05.2005

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

74 Agente: Tomás Gil, Tesifonte-Enrique

ES 2 231 279 T3

16.05.2005

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 231 279 T3 DESCRIPCIÓN Compuesto con propiedades de liberación de la hormona del crecimiento. 5

Campo de la invención La presente invención se refiere a un compuesto nuevo, a sus sales farmacéuticamente aceptables, a composiciones que las contienen, y su uso para tratar trastornos médicos que resultan de una deficiencia de la hormona del crecimiento.

10

15

20

25

Antecedentes de la invención La hormona del crecimiento es una hormona que estimula el crecimiento de todos los tejidos capaces de crecer. Además, la hormona del crecimiento es conocida por tener varios efectos en procesos metabólicos, p. ej., estimulación de síntesis proteínica y movilización de ácidos grasos libres y por causar una conexión en el metabolismo de la energía del metabolismo de los carbohidratos al de los ácidos grasos. Una deficiencia en la hormona del crecimiento puede resultar en varios trastornos médicos severos, p. ej., enanismo. La hormona del crecimiento se libera de la hipófisis. La liberación se hace bajo un estricto control de varias hormonas y neurotransmisores bien directa o indirectamente. La liberación de la hormona del crecimiento puede ser estimulada por la hormona liberadora de la hormona del crecimiento (GHRH) e inhibida por la somatostatina. En ambos casos las hormonas son liberadas del hipotálamo pero su acción está mediada principalmente por medio de receptores específicos localizados en la hipófisis. Otros compuestos que estimulan la liberación de la hormona del crecimiento de la hipófisis también han sido descritos. Por ejemplo la arginina, L-3,4-dihidroxifenilalanina (LDopa), glucagón, vasopresina, PACAP (péptido activador de la adenilil ciclasa de la hipófisis), agonistas del receptor muscarínico y un hexapéptido sintético, GHRP (péptido liberador de la hormona del crecimiento) liberan la hormona del crecimiento endógena bien por un efecto directo en la hipófisis o bien afectando la liberación de GHRH y/o somatostatina del hipotálamo.

30

En trastornos o condiciones en los que se desean unos niveles aumentados de la hormona del crecimiento, la naturaleza de la proteína de la hormona del crecimiento sólo no hace posible la administración parenteral. Además, otros secretagogos naturales que actúan directamente, p. ej., GHRH y PACAP, son polipéptidos más largos, por ello se prefiere la administración parenteral.

35

El uso de algunos compuestos para aumentar los niveles de hormonas del crecimiento en mamíferos ha sido propuesto previamente, p. ej. en EP 18 072, EP 83 864, WO 8302272, WO 8907110, WO 8901711, WO 8910933, WO 8809780, WO 9118016, WO 9201711, WO 9304081, WO 9413696, WO 9517423, WO 9514666, WO 9615148, WO 9622997, WO 9635713, WO 9700894, WO 9722620, WO 9723508, WO 9740023, y WO 9810653.

40

45

La composición de compuestos liberadores de la hormona del crecimiento es importante por su potencia liberadora de la hormona del crecimiento así como por su biodisponibilidad. Por lo tanto, es un objeto de la presente invención el hecho de proporcionar un compuesto nuevo con propiedades liberadoras de la hormona del crecimiento. Además, es un objeto el hecho de proporcionar un compuesto liberador de la hormona del crecimiento nuevo (secretagogo de la hormona del crecimiento) que sea específico y/o selectivo y no tenga o no tenga sustancialmente efectos secundarios, como p. ej. liberación de LH, FSH, TSH, ACTH, vasopresina, oxitocina, cortisol y/o prolactina. Es también un objeto el hecho de proporcionar un compuesto que tenga una buena biodisponibilidad oral. Resumen de la invención

50

Según la presente invención se proporciona un compuesto nuevo que actúa directamente en las células hipofisiarias bajo condiciones experimentales normales in vitro para liberar la hormona del crecimiento de éstas. El compuesto liberador de la hormona del crecimiento puede ser utilizado in vitro como única herramienta de investigación para comprender, entre otras cosas, cómo se regula la secreción de la hormona del crecimiento a nivel de la hipófisis.

55

Además, el compuesto liberador de la hormona del crecimiento de la presente invención puede también ser administrado in vivo para aumentar la liberación de la hormona del crecimiento endógena. Descripción de la invención 60

En consecuencia, la presente invención se refiere al compuesto 2-Amino-N-[(1R)-2-[(3R)-3-bencil-3-(N,N’,N’trimetilhidracinocarbonil)piperidin-1-il]-1-(1H-indol-3-ilmetil)-2-oxoetil]-2-metilpropionamida 65

2

ES 2 231 279 T3

5

10

o una sal derivada farmacéuticamente aceptable. 15

20

La estructura del compuesto que se puede obtener por el procedimiento como el descrito en el ejemplo 1 puede p. ej. ser comprobado mediante el análisis de difracción de rayos X (p. ej. según se describe en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 9ª Edición (1995), en especial páginas 160 y 561-562). Cualquier combinación posible de dos o más de las formas de realización descritas aquí está comprendida dentro del campo de la presente invención. Método preparatorio en general

25

El procedimiento preparatorio usado se basa en acoplamientos peptídicos bien conocidos en la técnica, y no deberían en ningún caso ser interpretados como limitadores de la invención de ninguna manera.

30

En el procedimiento, antes de un acoplamiento de residuos aminoácidos o peptídicos, un grupo de protección adecuado como tert-butiloxicarbonilo (Boc) puede ser extraído con métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. Es también posible evitar el uso de grupos de protección. Los aminoácidos apropiados pueden ser protegidos y desprotegidos por unos métodos conocidos en la técnica y descritos por p. ej. T.W. Green (Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Ed., John Wiley and Sons, Nueva York 1991). El Ejemplo 1 describe el procedimiento con detalle.

35

Como resolución de la mezcla racémica de 1-tert-butil éster del ácido 3-bencilpiperidina-1,3-dicarboxílico para obtener uno de los compuestos enantioméricos, el compuesto final obtenido por el procedimiento es el diastereómero 2-Amino-N-[(1R)-2-[(3R)-3-bencil-3-(N,N’,N’-trimetilhidracinocarbonil)piperidin-1-il]-1-(1H-indol-3-ilmetil)-2oxoetil]-2-metilpropionamida

40

45

50

en lugar de la mezcla de los dos diastereómeros. 55

El compuesto de la presente invención muestra una resistencia mejorada a la degradación proteolítica por enzimas porque es anatural, en particular porque los enlaces de amida naturales están reemplazados por la unión de miméticos de amida anaturales. Se prevé que la resistencia aumentada a la degradación proteolítica del compuesto de la invención en comparación con los péptidos liberadores de hormonas conocidos mejore su biodisponibilidad en comparación con la de los péptidos sugeridos en el documento precedente.

60

Composición farmacéutica

65

El compuesto de la presente invención puede opcionalmente estar en una forma salina aceptable farmacéuticamente como las sales de adición ácidas farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la presente invención que incluyen aquellas preparadas al reaccionar el compuesto de la fórmula 1 con un ácido inorgánico u orgánico como ácido hidroclórico, hidrobrómico, sulfúrico, acético, fosfórico, láctico, maléico, ftálico mandélico, cítrico, glutárico, glucónico, metanosulfónico, salicílico, succínico, tartárico, toluenosulfónico, trifluoracético, sulfámico o fumárico y/o agua. 3

ES 2 231 279 T3 El compuesto de la presente invención puede ser administrado en forma de sal de adición ácida aceptable farmacéuticamente o, si fuera apropiado, como un metal alcalino o metal alcalinotérreo o sal de alquilamonio inferior. Se cree que estas formas salinas muestran aproximadamente el mismo orden de actividad que las formas de base libres. 5

10

15

20

25

30

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende, como un ingrediente activo, un compuesto de la presente invención o una sal derivada farmacéuticamente aceptable junto con un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas que contienen un compuesto de la presente invención pueden ser preparadas por técnicas convencionales, p. ej. como se describe en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 1985 o en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 9ª Edición (1995). Las composiciones pueden hallarse en formas convencionales, por ejemplo cápsulas, comprimidos, aerosoles, soluciones, suspensiones o aplicaciones tópicas. El excipiente farmacéutico o diluyente empleado puede ser un excipiente sólido o líquido convencional. Ejemplos de excipientes sólidos son lactosa, sulfato de calcio, sacarosa, ciclodextrina, talco, gelatina, agar, pectina, acacia, estearato magnésico, ácido esteárico o éteres de alquilo inferior de celulosa. Ejemplos de excipientes líquidos son jarabe, aceite de cacahuete, aceite de oliva, fosfolípidos, ácidos grasos, aminas de ácidos grasos, polioxietileno o agua. De forma similar, el excipiente o diluyente puede incluir cualquier material de liberación prolongada conocido en la técnica, como gliceril monoestearato o gliceril diestearato, sólo o mezclado con una cera. Si un excipiente sólido se usa para la administración oral, la preparación puede hallarse en tabletas, colocada en una cápsula de gelatina dura en polvo o en forma granulada o puede estar en forma de pastilla o gragea. La cantidad de excipiente sólido variará mucho pero normalmente será de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 1 g. Si se usa un excipiente líquido, la preparación puede hallarse en forma de jarabe, emulsión, cápsula de gelatina blanda o líquido inyectable estéril como una suspensión o solución líquida acuosa o no acuosa. Una tableta típica que puede ser preparada mediante técnicas de disposición en tabletas convencionales puede contener: Núcleo:

35

40

Compuesto activo (como compuesto libre o sal derivada) Dióxido de silicio coloidal (Aerosil) Celulosa, microcrist. (Avicel) Goma de celulosa modificada (Ac-Di-Sol) Estearato magnésico

10 mg 1.5 mg 70 mg 7.5 mg

Revestimiento:

45

HPMC aprox. *Mywacett 9-40 T aprox.

9 mg 0.9 mg

*Monoglicérido acilado usado como plastificante para revestimiento pelicular.

50

55

60

65

Para la administración nasal, la preparación puede contener un compuesto de la presente invención disuelto o suspendido en un excipiente líquido, en particular un excipiente acuoso, para la aplicación de aerosoles. El excipiente puede contener aditivos como agentes de solubilización, p. ej. propilenoglicol, surfactantes, intensificadores de la absorción como lecitina (fosfatidil-colina) o ciclodextrina, o conservantes como parabenos. Generalmente, los compuestos de la presente invención se dispensan en forma de dosificación unitaria que comprenden 50-200 mg de ingrediente activo junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable por dosificación unitaria. La dosificación de los compuestos según esta invención es idóneamente 0.01-500 mg/día, p. ej. de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 mg, así como aproximadamente 10 mg por dosis, cuando se administra a pacientes, p. ej. seres humanos, como medicamento. En otro aspecto la presente invención se refiere a una composición farmacéutica en forma de dosis unitaria, que comprende como ingrediente activo de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 mg del compuesto de la fórmula general I o una sal derivada farmacéuticamente aceptable. Se ha demostrado que el compuesto de la presente invención posee la capacidad para liberar la hormona del crecimiento endógena in vivo. El compuesto puede en consecuencia usarse en el tratamiento de condiciones que 4

ES 2 231 279 T3 requieren unos niveles aumentados de la hormona del crecimiento plasmática como en seres humanos carecientes de la hormona del crecimiento o en pacientes ancianos o en el ganado. 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Así, en un aspecto particular, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para estimular la liberación de la hormona del crecimiento de la hipófisis, la composición que comprende, como ingrediente activo, un compuesto de la presente invención o una sal derivada farmacéuticamente aceptable junto con un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto ulterior, la presente invención se refiere al uso de un compuesto de la presente invención (o una sal derivada farmacéuticamente aceptable) o una composición farmacéutica de la presente invención para la preparación de un medicamento, en particular un medicamento para estimular la liberación de la hormona del crecimiento de la hipófisis. Para los expertos en la técnica, es bien conocido que los usos normales y potenciales de la hormona del crecimiento en los seres humanos son varios y numerosos. Así, el compuesto de la presente invención puede ser administrado para objetivos que estimulan la liberación de la hormona del crecimiento de la hipófisis y luego tendrán efectos o usos similares a los de la propia hormona del crecimiento. Los compuestos de la presente invención son útiles para: estimulación de la liberación de la hormona del crecimiento en la vejez, prevención de efectos secundarios catabólicos de glucocorticoides, prevención y tratamiento de la osteoporosis, tratamiento del síndrome del cansancio crónico (CFS), tratamiento del síndrome del cansancio agudo y pérdida muscular tras la cirugía electiva, estimulación del sistema inmunológico, aceleración de la cicatrización de una herida, aceleración de la recuperación de fracturas del hueso, aceleración de fracturas complicadas, p. ej. osteogénesis por distracción, tratamiento de emaciación tras fracturas, tratamiento del retraso del crecimiento, tratamiento del retraso del crecimiento provocado por fallo o insuficiencia renal, tratamiento de cardiomiopatía, tratamiento de emaciación relacionada con una enfermedad hepática crónica, tratamiento de la trombocitopenia, tratamiento del retraso del crecimiento relacionado con la enfermedad de Crohn, tratamiento del síndrome del intestino corto, tratamiento de la emaciación relacionada con la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), tratamiento de complicaciones relacionadas con transplantes, tratamiento de estatura corta fisiológica que tienen los niños carecientes de la hormona del crecimiento y estatura corta relacionada con enfermedades crónicas, tratamiento de la obesidad y retraso del crecimiento relacionado con la obesidad, tratamiento de la anorexia, tratamiento del retraso del crecimiento en relación con el síndrome Prader-Willi y síndrome de Turner; aumento del índice de crecimiento de un paciente con síndrome insensible a la hormona del crecimiento parcial, acelaración de la recuperación y reducción de la hospitalización de pacientes con quemaduras; tratamiento del retraso del crecimiento intrauterino, displasia esquelética, hipercortisolismo y síndrome de Cushing; inducción de la liberación de la hormona del crecimiento pulsátil; sustitución de la hormona del crecimiento en pacientes estresados, tratamiento de osteocondrodisplasias, síndrome de Noonan, esquizofrenia, depresiones, enfermedad de Alzheimer, cicatrización de una herida retardada y privación psicosocial, tratamiento del catabolismo relacionado con una disfunción pulmonar y dependencia de ventilador; tratamiento de insuficiencia cardiaca o disfunción vascular relacionada, tratamiento de función cardiaca perjudicada, tratamiento o prevención de infarto de miocardio, reducción de la tensión arterial, protección contra una disfunción ventricular o prevención de eventos de reperfusión; tratamiento de adultos en diálisis crónica; atenuación de respuestas catabólicas proteínicas después de una gran cirugía, reducción de la caquexia y pérdida proteínica debida a una enfermedad crónica como cáncer o SIDA; tratamiento de hiperinsulinemia que incluye nesidioblastosis, tratamiento para ayudar la inducción de la ovulación; estimulación del desarrollo tímico y prevención del declive relacionado con la edad de la función tímica, tratamiento de pacientes inmunosuprimidos; tratamiento de sarcopenia, tratamiento de emaciación relacionada con el SIDA; mejora de la resistencia muscular, movilidad, mantenimiento del espesor de la piel, homeóstasis metabólica y homeóstasis renal en la vejez frágil, estimulación de osteoblastos, reconstrucción ósea y crecimiento de cartílago; regulación de la ingesta de alimentos; estimulación del sistema inmunológico en animales de compañía y tratamiento de trastornos por envejecimiento en animales de compañía, promoción del crecimiento del ganado y estimulación del crecimiento de la lana en las ovejas, aumento de la producción de leche en el ganado, tratamiento del síndrome metabólico (síndrome X), tratamiento de resistencia a la insulina, incluido NIDDM, en mamíferos, p. ej. seres humanos, tratamiento de resistencia a la insulina en el corazón, mejora de la calidad del sueño y corrección del hiposomatotropismo relativo del envejecimiento debido a un aumento elevado del sueño REM y una reducción de la latencia REM, tratamiento de la hipotermia, tratamiento de la fragilidad relacionada con el envejecimiento, tratamiento de la insuficiencia cardiaca congestiva, tratamiento de fracturas de cadera, tratamiento de deficiencia inmunológica en individuos con una proporción celular de T4/T8 deprimida, tratamiento de atrofia muscular, tratamiento de la degradación musculoesqueletal en ancianos, aumento de la actividad de la quinasa B proteínica (PKB), mejora de la función pulmonar global, tratamiento de trastornos del sueño, tratamiento del retraso del crecimiento relacionado con el asma, tratamiento del retraso del crecimiento relacionado con la artritis reumática juvenil, y tratamiento del retraso del crecimiento relacionado con la fibrosis cística. Para las indicaciones arriba mencionadas la dosificación variará dependiendo del modo de administración y de la terapia deseada. No obstante, generalmente los niveles de dosificación entre 0.0001 y 100 mg/kg de peso corporal son administrados a diario a pacientes y animales para obtener una liberación eficaz de la hormona del crecimiento endógena. Además el compuesto de la presente invención no tiene o no tiene sustancialmente ningún efecto secundario, cuando se administra en los niveles de dosificación anteriores, estos efectos secundarios siendo p. ej. liberación de LH, FSH, TSH, ACTH, vasopresina, oxitocina, cortisol y/o prolactina. Normalmente, las formas de dosificación adecuadas para la administración oral, nasal, pulmonar o transdérmica comprenden de aproximadamente 0.0001 mg a aproximadamente 100 mg, preferiblemente de aproximadamente 0.001 mg a aproximadamente 50 mg de los compuestos de la presente invención mezclados con un excipiente farmacéuticamente aceptable o diluyente. 5

ES 2 231 279 T3 Opcionalmente, una composición farmacéutica de la invención puede comprender el compuesto de la presente invención combinado con uno o más compuestos que muestran una actividad diferente, p. ej., un antibiótico u otro material farmacológicamente activo. 5

La vía de administración puede ser cualquiera que transporte eficazmente el compuesto activo al lugar de acción apropiado o deseado, como oral, nasal, pulmonar, transdérmico o parenteral, siendo la oral la preferida. Aparte del uso farmacéutico del compuesto de la presente invención o de una sal derivada farmacéuticamente aceptable, puede ser útil como herramienta in vitro para investigar la regulación de la liberación de la hormona del crecimiento.

10

El compuesto de la presente invención puede también ser una herramienta útil in vivo para evaluar la capacidad de liberación de la hormona del crecimiento de la hipófisis. Por ejemplo, muestras de suero tomadas antes y después de la administración del compuesto a seres humanos pueden ser evaluadas para la hormona del crecimiento. La comparación de la hormona del crecimiento en cada muestra de suero determinará directamente la capacidad de la hipófisis del paciente para liberar la hormona del crecimiento.

15

El compuesto de la presente invención puede ser administrado a animales comercialmente importantes para aumentar su nivel y alcance del crecimiento, y para aumentar la producción de la leche. 20

Otro uso del compuesto de la presente invención se combina con otros secretagogos como GHRP (2 ó 6), GHRH y sus análogos, la hormona del crecimiento y sus análogos o somatomedinas que incluyen IGF-1 y IGF-2. Métodos farmacológicos

25

El compuesto de la presente invención puede ser evaluado in vitro por su eficacia y potencia para liberar la hormona del crecimiento en cultivos primarios de hipófisis de rata, y esta evaluación puede ser realizada según se describe abajo.

30

El aislamiento de células hipofisiarias de rata es una modificación de O. Sartor et al., Endocrinology 116, 1985, págs. 952-957. Se compraron ratas macho albinas a Sprague-Dawley (250 +/- 25 gramos) de M∅llegaard, Lille Skensved, Dinamarca. Las ratas fueron alojadas en jaulas agrupadas (cuatro animales/jaula) y colocadas en espacios con 12 horas de ciclo de luz. La temperatura ambiente varió de 19-24ºC y la humedad de 30 - 60%.

35

40

45

Las ratas fueron decapitadas y las hipófisis seccionadas. Los lóbulos del neurointermediario fueron eliminados y el tejido restante fue inmediatamente colocado en un tampón de aislamiento helado (medio de Gey (Gibco 04104030) completado con 0.25% de D-glucosa, 2% de aminoácidos no esenciales (Gibco 043-01140) y 1% de albumina de suero bovino (BSA) (Sigma A-4503)). El tejido fue cortado en pedazos pequeños y transferido a un tampón de aislamiento completado con 3.8 mg/ml de tripsina (Worthington #3707 TRL-3) y 330 mg/ml de ADNasa (Sigma D4527). Esta mezcla fue incubada a 70 rotaciones/min durante 35 minutos a 37ºC en un 95/5% atmósfera de O2 /CO2 . El tejido fue luego lavado tres veces en el tampón anterior. Usando una pipeta estándar pasteur, el tejido fue luego aspirado en células individuales. Después de la dispersión, las células fueron filtradas a través de un filtro de nilón (160 mm) para eliminar el tejido no digerido. La suspensión celular fue lavada 3 veces con un tampón de aislamiento completado con un inhibidor de tripsina (0.75 mg/ml, Worthington #2829) y finalmente resuspendido en un medio de cultivo; DMEM (Gibco 041-01965) completado con 25 mM de HEPES (Sigma H-3375), 4 mM de glutamina (Gibco 043-05030H), 0.075% de bicarbonato sódico (Sigma S-8875), 0.1% de aminoácido no esencial, 2.5% de suero fetal de ternera (FCS, Gibco 011-06290), 3% de suero de caballo (Gibco 034-06050), 10% de suero de rata fresco, 1 nM de T3 (Sigma T-2752) y 40 mg/l dexametasona (Sigma D-4902) pH 7.3, a una densidad de 2 X 105 células/ml. Las células fueron sembradas en placas de microtitración (Nunc, Dinamarca), 200 ml/pocillo, y cultivadas durante 3 días a 37ºC y CO2 al 8%. Prueba del compuesto

50

55

60

Después del cultivo, las células fueron lavadas dos veces con un tampón de estimulación (Hanks Balanced Salt Solution (Gibco 041-04020) completado con 1% de BSA (Sigma A-4503), 0.25% de D-glucosa (Sigma G-5250) y 25 mM de HEPES (Sigma H-3375) pH 7.3) y preincubado durante 1 hora a 37ºC. El tampón fue intercambiado con un tampón de estimulación de 90 ml (37ºC). Una solución de un compuesto de diez ml fue añadida y las placas fueron incubadas durante 15 minutos a 37ºC y CO2 al 5%. El medio fue decantado y analizado por su contenido de GH en un sistema de prueba rGH SPA. El compuesto fue evaluado en dosis que varían de 10 pM a 100 mM. Una relación dosis-respuesta fue construida usando la ecuación Hill (Fig P, Biosoft). La eficacia (GH máxima liberada, Emax ) fue expresada en % del Emax de GHRP-6. La potencia (EC50 ) fue determinada como la concentración que induce la estimulación máxima media de la liberación de GH. Los compuestos de la presente invención pueden ser evaluados por su estabilidad metabólica usando el procedimiento descrito abajo:

65

El compuesto está disuelto en una concentración de 1 mg/ml en agua. Se añaden 25 ml de esta solución a 175 ml de la solución enzimática respectiva (dando como resultado una proporción enzima:substrato (p/p) de aproximadamente 1:5). La solución se deja a 37ºC durante toda la noche. Se analizan 10 ml de varias soluciones de degradación contra 6

ES 2 231 279 T3 una muestra-cero correspondiente usando una espectrometría de masas mediante electrospray de inyección por flujo (ESMS) con vigilancia del ión seleccionado del ión molecular. Si la señal ha disminuido más del 20% en comparación con la muestra-cero, el resto de la solución se analiza por HPLC y espectrometría de masas para identificar la extensión y lugar(es) de degradación con precisión. 5

Varios péptidos estándar (ACTH 4-10, angiotensina 1-14 y Glucagón) han sido incluidos en las pruebas de estabilidad con el objetivo de verificar la capacidad de varias soluciones para degradar péptidos. Se compraron péptidos estándar (angiotensina 1-14, ACTH 4-10 y glucagón) a Sigma, MO, EEUU) 10

Se compraron enzimas (tripsina, quimiotripsina, elastasa aminopeptidasa M y carboxipeptidasa Y y B) a Boehringer Mannheim Gmbh (Mannheim, Alemania). 15

Mezcla de enzima pancreática: tripsina, quimiotripsina y elastasa en 100 mM de bicarbonato de amonio pH 8.0 (todas las concentraciones 0.025 mg/ml). Mezcla de carboxipeptidasa: carboxipeptidasa Y y B en 50 mM de acetato de amonio pH 4.5 (todas las concentraciones 0.025 mg/ml).

20

Solución de aminopeptidasa M: aminopeptidasa M (0.025 mg/ml) en 100 mM de bicarbonato de amonio pH 8.0. El análisis espectrométrico de masas fue realizado usando dos espectrómetros de masas diferentes. Un instrumento LC-MS triple cuadrupolo Sciex API III (instrumentos Sciex, Thornhill, Ontario) equipado con una fuente iónica de electrospray y un instrumento Bio-lon 20 tiempo-de-vuelo Plasma Desorption (Bio-Ion Nordic AB, Uppsala, Suecia).

25

30

35

La cuantificación del compuesto (antes y después de la degradación) fue hecha en el instrumento API III usando un control fónico individual del ión molecular en cuestión con inyección de flujo de la sustancia a analizar. El flujo líquido (MeOH:agua 1:1) de 100 ml/min fue controlado por una unidad de HPLC ABI 140B (Applied Biosystems Divisions, Foster City, CA). Los parámetros del instrumento fueron dispuestos hasta unas condiciones de operación estándar, y el control de SIM fue realizado usando el ión molecular más intenso (en la mayoría de los casos esto correspondió al ión molecular doblemente cargado). La identificación de los productos de degradación también implicó el uso de la espectrometría de masas por desorción plasmática (PDMS) con aplicación de las muestras en objetivos revestidos de nitrocelulosa y ajustes instrumentales estándar. La exactitud de las masas determinadas por la presente es generalmente mejor del 0.1%. La separación y aislamiento de productos de degradación fue realizada usando una columna de HPLC 4.6x105 mm de fase inversa C-18 HY-TACH (Hewlett-Packard Company, Palo Alto, CA) con un acetonitrilo estandar: gradiente de separación de TFA. El sistema de HPLC usado fue HP1090M (Hewlett-Packard Company, Palo Alto, CA).

40

45

50

55

60

65

7

ES 2 231 279 T3 Métodos farmacocinéticos El compuesto de la presente invención puede ser evaluado por su biodisponibilidad oral, y esta evaluación puede ser realizada según se describe más abajo. 5

Las farmacocinéticas del compuesto pueden ser investigadas en perros Beagle en ayunas. La administración intravenosa y oral del compuesto de prueba, en una solución de glucosa al 5%, fue separada por un lavado de una semana. 10

Se recogieron inmediatamente unas muestras de sangre antes de la administración del medicamento (tiempo cero) y 0.08, 0.25, 0.50, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, y 6.0 horas después de la administración. Las muestras de plasma fueron almacenadas congeladas ( 7. Las capas fueron separadas, y la capa orgánica fue lavada con H2 O (100 ml), solución salina (100 ml), secada con MgSO4 , filtrada y concentrada al vacío para proporcionar el producto (27 g) como una espuma naranja. HPLC (h8):

Rt = 10,03 min.

45

Fase I

50

Tert-butil éster del ácido {1-[(1R)-2-[(3R)-3-Bencil-3-(N,N’,N’-trimetilhidracinocarbonil)piperidin-1-il]-1-(1Hindol-3-ilmetil)-2-oxo-etilcarbamoil]-1-metiletil}carbámico

55

60

65

Boc-Aib-OH (11,9 g, 58,4 mmol) fue disuelto en dimetilacetamida (125 ml) en un matraz de un cuello de fondo redondo (500 ml) equipado con un agitador magnético y borboteador de nitrógeno. A la solución agitada a temperatura ambiente se añadió 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (7,95 g, 58,4 mmol), hidrocioruro 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (11,2 g, 58,4 mmol), y diisopropiletilamina (13,0 ml, 75,8 mmol). Después de 20 min. se añadió una solución (amarilla con precipitación) del producto de la fase h (27,0 g, 58,4 mmol) en dimetilacetamida (125 ml). La reacción fue agitada a temperatura ambiente durante 3 h. La mezcla fue añadida a EtOAc (750 ml) y lavada 13

ES 2 231 279 T3

5

con NaHSO4 acuoso (300 ml, 10%). Las capas permitieron su separación, y la capa acuosa fue extraída de nuevo con EtOAc (500 ml). Las capas orgánicas combinadas fueron lavadas con H2 O (100 ml), NaHCO3 acuoso (300 ml, saturado), H2 O (100 ml), solución salina (300 ml), secadas con MgSO4 , filtradas y concentradas al vacío hasta aprox. 500 ml. Luego se añadió SiO2 (150 g) y el EtOAc restante extraido al vacío para dar un polvo seco que fue aplicado sobre un filtro envuelto con SiO2 (150 g), lavado con heptano (1 L), y se obtuvo el compuesto deseado (33.9 g) como una espuma naranja. HPLC (h8):

Rt = 14,05 min.

10

Fase i 15

Fumarato de 2-Amino-N-[(1R)-2-[(3R)-3-bencil-3-(N,N’,N’-trimetilhidracinocarbonil)piperidin-1-il]-1-(1H-indol-3-ilmetil)-2-oxoetil]-2-metilpropionamida

20

25

30

35

40

45

50

El producto de la fase i (23,8 g, 36,8 mmol) fue disuelto en de EtOAc (800 ml) (solución amarillo claro) en un matraz de un cuello de fondo redondo (1L) equipado con agitación magnética. El matraz fue luego colocado en un baño de agua (temp: 10-20 (C), y se pasó el gas de HCl a través de la solución durante 5 min. (precipitación de tipo en polvo). Después de la agitación durante 1 hora (precipitación de gran cantidad de polvo amarillo), la solución fue lavada con N2 para eliminar el exceso de HCl. El precipitado fue extraído por filtración suave y secado al vacío a 40ºC durante toda la noche. El precipitado no-cristalínico fue disuelto en H2 O (500 ml) y lavado con EtOAc (100 ml). Luego se añadió CH2 Cl2 (1000 ml) y Na2 CO3 sólido hasta pH > 7. Las 2 capas fueron separadas, y la capa acuosa fue extraída de nuevo con CH2 Cl2 (200 ml). Las capas orgánicas combinadas fueron lavadas con una solución salina (100 ml), secadas con MgSO4 y filtradas. El solvente fue evaporado bajo presión reducida y disuelto en EtOAc (500 ml) en un matraz de un cuello de fondo redondo (1L) equipado con agitación magnética. Se añadió lentamente (5 min.) una suspensión de ácido fumárico (3,67 g) en isopropanol (20 ml) y EtOAc (50 ml), dando como resultado la precipitación de una sal cristalínica blanca. Después de 1 hora la precipitación fue aislada por filtración y secada durante toda la noche al vacío a 40ºC para dar la sal de fumarato del compuesto de 2-amino-N-[(1R)-2-[(3R)-3-bencil-3-(N,N’,N’-trimetilhidracinocarbonil)piperidin-1-il]-1-(1H-indol-3-ilmetil)-2-oxoetil]-2-metilpropionamida (13,9 g) como un polvo blanco. HPLC (Al):

Rt = 33,61 min.

HPLC (B1):

Rt = 34,62 min.

LC-MS:

Rt = 5,09 min.

55

60

65

14

(m+1) = 547,4

ES 2 231 279 T3 REIVINDICACIONES 1. 2-Amino-N-[(1R)-2-[(3R)-3-bencil-3-(N,N’,N’-trimetilhidracinocarbonil)piperidin-1-il]-1-(1H-indol-3-ilmetil)-2-oxoetil]-2-metilpropionamida 5

10

15

o una sal derivada farmacéuticamente aceptable. 20

2. Una composición farmacéutica que comprende, como ingrediente activo, un compuesto según la reivindicación 1 junto con un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. 25

3. Una composición farmacéutica según la reivindicación 2 para estimular la liberación de la hormona del crecimiento de la hipófisis. 4. Una composición farmacéutica según la reivindicación 2 ó 3 para la administración a animales para aumentar su nivel y alcance de crecimiento, para aumentar su producción de leche y de lana, o para el tratamiento de dolencias.

30

5. Uso de un compuesto según la reivindicación 1 o una composición farmacéutica según la reivindicación 2 para la preparación de un medicamento. 6. Uso según la reivindicación 5 donde el medicamento es para estimular la liberación de la hormona del crecimiento de la hipófisis de un mamífero.

35

40

45

50

55

60

65

15